Cryo

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 9930 (2022) Citer cet article

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La microscopie électronique cryogénique est devenue un outil puissant pour étudier les objets biologiques. Pour les objets non biologiques (solutions, gels, dispersions, argiles), la polémique sur l'interprétation des résultats de microscopie cryogénique est toujours en cours se scindant sur deux tendances contradictoires : considérer la structure comme un état quasi réel de l'échantillon ou comme des artefacts de congélation. Dans cette étude, une microstructure d'une gamme de solutions et dispersions aqueuses stables (agar, kaolin, montmorillonite, nanoparticules) a été étudiée au moyen de cryo-SEM et de LSM confocal afin de comparer les structures cryofixées et non congelées. La corrélation constatée entre ces deux méthodes pour les systèmes étudiés (agar, kaolin, montmorillonite, NPs) a permis d'affirmer que la microstructure ordonnée est une caractéristique inhérente à ces systèmes. Certaines incohérences dans les dimensions de la microstructure ont été discutées et prescrites aux différences dans les couches de masse et d'interface. Soi-disant, les solutions de NaCl possèdent également une microstructure dynamique (niveau femtoseconde) d'amas d'eau pure et d'ions Na+ et Cl- solvatés qui peuvent avoir un impact sur les propriétés anormales de l'électrolyte.

Depuis la découverte de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) il y a plus de trente ans, de nombreuses données ont été accumulées dans ce domaine1,2. Cette technique d'imagerie permet d'observer des spécimens à l'échelle micro- et nanométrique dans leur environnement aqueux natif, sans séchage qui provoque une déformation irréversible de la structure. L'observation devient possible grâce à la solidification de l'eau par des agents cryogéniques, c'est-à-dire la cryo-fixation. Cette dernière est une étape critique dans cette technique : la congélation ultrarapide empêche la croissance des cristaux de glace en gardant intactes les structures d'origine. La cryo-fixation est généralement réalisée en plongeant un échantillon dans un cryo-agent (slush d'azote, propane, éthane, etc.), suivi d'une fracturation (pour observer la structure interne de l'échantillon) et d'une sublimation (c.-à-d. Gravure à la glace) qui permet de observer la structure sans couche d'eau. Aujourd'hui, la technique cryo-EM est devenue un outil puissant pour étudier les objets biologiques. Une longue discussion sur la congruence entre leur microstructure à l'état cryo-fixe et non congelé a abouti à un consensus sur le fait que les résultats cryo-EM reflètent l'état quasi réel des spécimens biologiques dans une partie de leurs éléments structurels plus denses (squelette, membrane, etc. )1,2. Le consensus était basé sur les données accumulées montrant la corrélation entre les différentes techniques d'imagerie. Quant aux composants biologiques liquides et gélatineux (mucus, liquides inter et extracellulaires, etc.), subsistent les doutes qui peuvent être attribués aux difficultés de visualisation des structures de faible densité (faible contraste, mobilité, etc.) . L'une des façons de résoudre ce problème est de développer des techniques qui permettent d'observer des échantillons humides dans des conditions proches des conditions natives à haute résolution. Dans cette direction, le développement d'un nouveau SEM atmosphérique (ASEM), qui est une combinaison d'un microscope électronique à balayage inversé (avec une boîte de culture ouverte détachable) et d'un microscope à fluorescence, a été rapporté3. L'ASEM permet d'observer quasi-simultanément la même zone depuis le haut et le bas de l'échantillon en solution aqueuse (encapsulée dans un film de SiN perméable aux électrons) à pression atmosphérique. Grâce à cette technique, les connexions neuronales, les ostéoblastes, le réticulum endoplasmique, les tissus osseux, l'endocytose cellulaire et la mitose ont été imagés3,4.

En comparaison avec les objets biologiques, les systèmes aqueux non biologiques (par exemple, les solutions, les dispersions, les gels, les argiles) ne possèdent pas de limites de phase distinctes (denses) dans l'eau, et l'interprétation de leurs résultats cryo-EM est encore ambiguë et divisée en deux tendances contradictoires. Selon une tendance, la microstructure observée sur les échantillons cryofixés est interprétée comme le résultat de la formation de cristallites aqueuses - comme un artefact de congélation5,6,7,8,9,10,11. Ce dernier apparaît lorsque des substances dissoutes/dispersées diffusent vers la périphérie des cristaux de glace conduisant à la formation de structure7. Dans une autre tendance, la microstructure des échantillons cryo-fixés est considérée comme un état proche de la réalité. Ce point de vue est souvent étayé par une corrélation avec des images de microscopie optique ou confocale à balayage laser (LSM), comme cela a été montré, par exemple, pour les fluides de fracturation en mousse, les émulsions formées avec de la pectine de pomme, les dispersions de nanoparticules, les argiles minérales8,11,12, 13,14,15. Les différences remarquées dans la dimension de la microstructure (si l'on compare les résultats LSM et cryo-EM) n'ont pas été interprétées et, par conséquent, déroutantes8. Les opinions contradictoires de la microstructure cryo-fixée indiquent une incohérence des résultats expérimentaux avec le concept généralement accepté pour les solutions et les colloïdes en tant que molécules/ions/particules réparties de manière homogène dans le solvant16. Ainsi, la polémique sur l'interprétation des observations de microscopie cryogénique d'échantillons non biologiques est toujours en cours, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour éclaircir ce problème.

Une autre question essentielle est liée à la vitrification de l'eau et/ou à la taille des cristaux de glace formés lors de la cryofixation. Il est connu que l'eau pure peut être vitrifiée sous forme de couche mince ou de petites gouttelettes à des vitesses de congélation rapides (également appelées "vitesses de refroidissement critiques (minimales)"), qui sont de l'ordre de ~ 106 K/s2,17,18. La présence de solutés réduit les taux de refroidissement critiques par des ordres de grandeur. Pour une variété de solutés (éthanol, méthanol, chlorure de sodium, glycérol, éthylène glycol, dextrose, etc.), la vitesse de refroidissement critique est une fonction exponentielle de la concentration et est en corrélation avec le rayon de Stokes du soluté17. Dans la pratique cryo-EM, cependant, les taux de refroidissement obtenus sont encore bien en deçà des limites théoriques18. On pense que la fraction volumique de cristal de glace est suffisamment petite dans l'échantillon et n'empêche pas les reconstructions à haute résolution2,18. Autrement dit, pour les échantillons sans limites d'interphase distinctes dans l'eau, des doutes subsistent - qu'observons-nous vraiment lors des mesures cryo-EM : structure de l'échantillon ou artefacts de congélation ? Observons-nous que la microstructure dynamique du solvate existait à l'état liquide que nous avons "arrêté" au moment de la cryo-fixation, ou que la microstructure a été créée au moment de la congélation ? Le problème est encore compliqué par des similitudes évidentes entre les structures cryo-fixées des solutions et les dispersions de nature chimique différente des solutés (minéraux argileux, polysaccharides, gels colloïdaux, etc.) : des microstructures en nid d'abeille, spongieuses et lamellaires ont été couramment observées10,11,14 ,15. Ces similitudes de microstructure étaient généralement interprétées comme une preuve de l'existence d'artefacts de gel qui ne représentent pas la réalité8,9.

Dans cette étude, l'objectif était d'étudier une microstructure de solutions aqueuses stables et de dispersions de substances d'origine chimique différente (agar, kaolin, montmorillonite, oxyde de fer ultrapetit et nanoparticules d'argent (NPs MAg)), au moyen de la microscopie électronique à balayage cryogénique (cryo-SEM) et LSM confocal, et de comparer les microstructures cryofixées et non congelées. Dans les deux méthodes, les échantillons ont été étudiés comme une goutte de volume similaire (et non comme une couche mince, dont la structure peut différer considérablement de la microstructure globale et dépend des interactions interphases19). En outre, une étude cryo-SEM de solutions de NaCl (0, 2 à 20% en poids) a été réalisée et une microstructure dépendante de la concentration hautement ordonnée a été remarquée. Une hypothèse d'une structuration dynamique des ions Na+ et Cl− solvatés et des amas d'eau pure à l'état liquide a été faite.

Dans notre étude, les échantillons ont été maintenus volumineux pendant les mesures cryo-SEM et LSM confocales. Ceci est important car la microstructure de la couche mince diffère considérablement de celle des matières en vrac étant fortement dépendante de l'interaction des limites de phase19. Au cryo-SEM, un échantillon a été placé ou versé dans un trou du talon de l'échantillon (Fig. 1a). La préparation des échantillons pour les mesures LSM a été réalisée à l'aide d'un joint en caoutchouc pour fournir du volume (augmenter l'épaisseur des couches) (Fig. 2a). Les colorants fluorescents (fluorescéine, rhodamine B, Atto 550 NHS) introduits dans les échantillons, ont permis d'utiliser une puissance laser ultrabasse (0,01–0,15 mW) qui minimise le chauffage, la distorsion et l'évaporation de l'eau de l'échantillon pendant les mesures.

Photos d'un morceau de gel d'agar avec rhodamine B et navette d'échantillon avec support en aluminium de 10 mm avec le gel préparé pour les mesures cryo-SEM (a); images cryo-SEM de gel d'agar avec rhodamine B (b).

Photos d'un morceau de gel d'agar avec de la rhodamine B et des lames de verre avec le gel préparé pour les mesures confocales LSM (a); images LSM confocales de gel d'agar avec de la rhodamine B (longueur d'onde d'excitation 561 nm, puissance laser ~ 0,14 mW) : « îles » (b), globulaires (c images gauche et centrale) et structures en couches (c droite) ; microstructures ordonnées (d). Le contraste et la luminosité ont été ajustés.

Deux types de microstructures, spongieuses et lamellaires, qui coïncident comme des "îlots" chaotiquement mélangés avec des formes irrégulières (taille de 20 à 400 µm) et des bords dentelés, ont été observés lors de mesures cryo-SEM de gel d'agar avec de la rhodamine B (Fig. 1b) . La microstructure spongieuse est plus fine, à l'échelle d'environ 1 µm, tandis que la lamellaire est plus grande, à l'échelle d'environ 10 µm. Les «îles» sont séparées de la microstructure des lamelles à plus grande échelle par une coquille - une fine couche qui diffère de la microstructure en vrac de «l'île» (Fig. 1b, deuxième rangée). Les lamelles sont strictement orientées à des distances allant jusqu'à 100 µm, tandis que les éléments lamellaires simples sont discontinus (Fig. 1b, rangée du bas). Les mesures Cryo-SEM ont montré la présence d'une microstructure ordonnée dans un gel d'agar avec de la rhodamine B.

Les images LSM confocales du gel d'agar avec de la rhodamine B ont également révélé des "îlots" aux formes irrégulières (Fig. 2b). Comme pour les résultats cryo-SEM, les "îlots" sont des structures volumétriques aux formes irrégulières de 20 à 400 µm. Dans la plupart des cas, l'espace « îles » et inter-« îles » semblait uniforme et l'ordre de la microstructure n'est pas visible. Néanmoins, plusieurs exemples distincts d'ordre de microstructure ont été trouvés, principalement à proximité de la limite de la lame de verre, lorsque «l'îlot» repose sur le verre ou a été «cassé» (Fig. 2c – d). En particulier, certaines des "îles" se sont avérées être constituées de globules (~ 20 µm de diamètre) empilés en rangées; la largeur de la rangée était d'environ 40 µm (Fig. 2c, gauche, centre). De tels globules n'ont pas été observés au cours de l'étude cryo-SEM. De plus, une structure en couches a été remarquée sur la limite de "l'île" ; la distance entre les couches était de l'ordre de 8 à 12 µm (Fig. 2c, à droite). Les structures allongées très ordonnées (avec une périodicité d'environ 5 µm) et poreuses (échelle d'environ 10 µm) présentées à la Fig. 2d sont en corrélation avec les lamelles et les structures spongieuses observées lors des mesures cryo-SEM (voir Fig. 1b, rangée du bas). Ainsi, les mesures LSM confocales de l'échantillon, sans aucune étape d'ouverture de la structure (élimination de l'eau, fracturation, sublimation), fournissent la preuve de l'existence de la microstructure dans le gel d'agar non congelé.

Dans nos études précédentes, il a été démontré que les NP MAg synthétisées avec des extraits naturels (Z. officinale, A. muscaria, S. crispa) forment des hydrocolloïdes stables avec une microstructure distinctive14,20,21. Des composés d'extraits naturels (polysaccharides, protéoglycanes, etc.) forment une couche superficielle sur ces NP, assurant une grande stabilité de leurs hydrocolloïdes. La microstructure hautement ordonnée des hydrocolloïdes des NP révèle principalement des bandes parallèles (lamelles) et des structures en forme d'éponge. L'introduction de rhodamine B (pour le bien de l'imagerie LSM), ainsi que tout changement dans la composition hydrocolloïde, peut potentiellement influencer la microstructure hydrocolloïde. C'est pourquoi, l'imagerie cryo-SEM et LSM a été réalisée pour l'hydrocolloïde MAg NPs avec rhodamine B. Ainsi, les mesures cryo-SEM ont révélé que les NPs MAg avec rhodamine B contiennent différents types de microstructures, telles que des lamelles et des éponges, avec différentes échelles ( ~ 1 µm et ~ 10 µm, entre éléments individuels) (Fig. S2). Les mesures Cryo-SEM EDS ont confirmé que les éléments de microstructure sont formés par les NP : les éléments Fe et Ag sont dans les éléments de microstructure, et O (de l'eau) est entre eux (Fig. S2, a). Les images à fort grossissement de l'élément de microstructure montrent qu'il se compose de globules de 100 nm (qui sont des nanoparticules avec une coque de solvatation) (Fig. S2, b). De plus, une multiplicité de formes arrondies plus grandes, de 30 à 100 µm de taille, ont été observées (Fig. 3, marquées par des lignes pointillées jaunes). Ces structures arrondies sont constituées de lamelles ou de structures spongieuses à l'échelle de 10 µm à l'intérieur et d'une coquille à petite échelle (≤ 1 µm) à l'extérieur (Fig. 3, images du bas).

Photos d'une goutte d'hydrocolloïde MAg NPs avec rhodamine B et navette d'échantillon avec support en aluminium de 10 mm avec l'échantillon préparé pour les mesures cryo-SEM (a), images cryo-SEM d'hydrocolloïde MAg NPs avec rhodamine B : les structures arrondies sont entourées de pointillés lignes (b).

Les mesures LSM confocales de l'hydrocolloïde MAg NPs avec la rhodamine B ont révélé la coexistence de deux structures: des formes irrégulières à plus petite échelle (~ 5–10 µm) et des formes arrondies plus grandes (20–100 µm). La figure 4c présente des images LSM confocales de cet hydrocolloïde à la longueur d'onde d'excitation 514 nm et en mode réflexion. Le mode de réflexion a montré un contour de bord clair de la structure arrondie, la simulation 2,5 D (x, y, intensité) a confirmé une réflexion intensive sur les bords des structures observées. Les plus grandes formes arrondies observées sont similaires en taille et en forme à celles observées lors de l'étude cryo-SEM. L'uniformité de ces structures arrondies peut être liée à l'existence d'une coque à structure minuscule qui a été remarquée lors des mesures cryo-SEM (Fig. 4, images du bas).

Photos d'une goutte d'hydrocolloïde MAg NPs avec de la rhodamine B et des lames de verre avec joint en caoutchouc avec l'échantillon entre eux préparé pour l'imagerie confocale LSM (a) ; images LSM confocales (longueur d'onde d'excitation 514 nm, puissance laser 0,01 mW) (b) ; mesures en double canal (excitation 514 nm et mode réflexion), simulation en 2,5 dimensions (2,5D) (axes x, y, intensité) (c).

Dans la prochaine série d'expériences, l'argile de kaolin avec de la fluorescéine a été utilisée pour l'imagerie cryo-SEM et confocale LSM. La poudre de kaolin (Al2(OH)4Si2O5) est hydrophile, insoluble dans l'eau et peut former un hydrocolloïde stable - kaolin. Pour fournir un meilleur signal de fluorescence, deux types d'argiles de kaolin ont été préparés, avec de la rhodamine B et de la fluorescéine. Le colorant de rhodamine B n'a pas amélioré l'imagerie (non illustré) qui peut être lié à une mauvaise adsorption de la rhodamine B sur les particules de kaolin (ce colorant est bien soluble dans l'eau et existe principalement dans la phase aqueuse de l'argile de kaolin (le surnageant est coloré)). La fluorescéine a une meilleure affinité pour les particules de kaolin (surnageant incolore) et offre un meilleur contraste lors de l'imagerie LSM confocale qui peut être liée à sa faible solubilité dans l'eau (soluble dans 1 M NaOH, 50 mg/ml) et une meilleure adsorption sur les particules de kaolin. Des mesures Cryo-SEM d'argile de kaolin avec de la fluorescéine ont révélé des microstructures de lamelles et d'éponges (Fig. 5). Les parois de ces structures sont constituées de microplaques plates - des particules de kaolin (entourées d'une ligne pointillée jaune sur la figure 5b).

Photos d'une goutte d'argile de kaolin avec de la fluorescéine et d'une navette d'échantillon avec de l'argile de kaolin dans un support en aluminium préparé pour la congélation par plongée dans de l'azote (a), images cryo-SEM d'argile de kaolin avec de la fluorescéine (b). Photos d'argile de kaolin avec de la fluorescéine, des lames de verre avec un joint en caoutchouc avec de l'argile de kaolin entre elles pour l'imagerie LSM confocale (c) ; images LSM confocales obtenues à la longueur d'onde d'excitation 405 nm, puissance laser 0,002 mW (lumière-kaolin, obscurité-eau). Des exemples d'alignement parallèle de microplaques de kaolin sont indiqués par des lignes pointillées jaunes (d).

Les mesures LSM confocales ont révélé une distribution plutôt chaotique des microplaques de kaolin avec un trait caractéristique - alignement parallèle des microplaques de kaolin (Fig. 5d, contraste clair - kaolin, obscurité - eau). Certains exemples d'alignement parallèle de microplaques de kaolin sont entourés d'une ligne pointillée sur la figure 5d. Cette dernière observation est en corrélation avec les mesures cryo-SEM.

Dans la continuité de l'étude, une autre argile minérale, la montmorillonite, a été utilisée pour l'imagerie cryo-SEM et confocale LSM (Fig. 6a, c). La poudre de montmorillonite ((Na,Ca)0,33(Al,Mg)2(Si4O10)(OH)2·nH2O) est hydrophile, insoluble dans l'eau et peut former un hydrocolloïde stable - argile montmorillonite. Pour améliorer l'imagerie LSM confocale, deux échantillons d'argile montmorillonite avec des colorants fluorescents, de la fluorescéine et de l'ester Atto 550 NHS, ont été préparés. Les mesures Cryo-SEM ont révélé une microstructure spongieuse poreuse de l'argile montmorillonite (Fig. 6b). L'échelle de cette microstructure différait de 3 à 4 fois (Fig. 6b, première rangée, montre des microstructures à l'échelle d'environ 4 µm et d'environ 11 µm). Les mesures LSM confocales (Fig. 6d) ont également révélé une structure perforée hautement poreuse qui correspond aux résultats publiés précédemment2,8,9. Ici, la taille des pores était principalement petite, ~ 1 µm, avec des inclusions uniques de pores plus grands (5 à 20 µm).

Photos d'une argile montmorillonite avec fluorescéine, navette d'échantillons avec l'échantillon pour cryo-SEM (a), images cryo-SEM d'argile montmorillonite avec fluorescéine (b). Photos d'une argile montmorillonite avec de la fluorescéine, une goutte entre les lames de verre avec joint en caoutchouc pour l'imagerie confocale LSM (c) ; images LSM confocales obtenues à excitation 405 nm, puissance laser 0,002 mW (lumière-montmorillonite, obscurité-eau) (d).

En outre, le colorant fluorescent Atto 550 NHS ester (MFCD05865403) a été introduit dans l'argile montmorillonite. Ce colorant de fluorescence est soluble dans le DMSO et a une affinité pour les particules de montmorillonite (surnageant incolore). L'observation visuelle de l'argile montmorillonite avec l'ester Atto 550 NHS a révélé que l'ajout de ce colorant diminuait la viscosité et augmentait la fluidité. Cette dernière était liée à la diminution de la tension superficielle de l'argile montmorillonite due à l'ajout de DMSO dont la tension superficielle est significativement inférieure à celle de l'eau (71,9 et 42,3 mN.m−1 (à 303,2 K) pour l'eau et le DMSO, respectivement)22. En raison de la fluidité accrue (mouvement rapide des particules), les mesures confocales LSM ont été effectuées sans joint en caoutchouc, recouvrant l'argile d'une couverture en verre qui réduit l'épaisseur de l'échantillon (~ 300 µm). Les mesures LSM confocales (longueur d'onde d'excitation 561 nm, puissance laser ultrabasse ~ 0, 01 mW) ont révélé des structures droites et longues - lignes (lamelles) (Fig. 7a). Les lignes étaient regroupées et fortement parallèles. Ils formaient également des angles aigus (~ 38°). Nous relions l'observation des structures lamellaires à l'amélioration de l'interaction (affinité) entre l'argile minérale et la surface de la lame de verre (en raison de la diminution de la tension superficielle et de l'amélioration de la mouillabilité de l'argile). Fait intéressant, des structures à angle aigu similaires ont été remarquées sur la surface de l'argile montmorillonite, à la limite échantillon / air, lors des mesures cryo-SEM (Fig. 7b). Ces résultats ont montré que l'argile montmorillonite peut révéler différents types de microstructure, à savoir une structure perforée poreuse uniforme et de longues lignes très parallèles (c'est-à-dire des lamelles), en fonction du colorant fluorescent ajouté et, probablement, de l'épaisseur de la couche. Ces résultats montrent que la microstructure de l'argile montmorillonite observée lors des mesures confocales au LSM dépend fortement de l'interaction d'interface à la frontière argile/verre. Pour conclure, les résultats des mesures cryo-SEM et LSM confocales de l'argile montmorillonite avec de la fluorescéine sont en corrélation les uns avec les autres, montrant l'existence d'une microstructure bien organisée.

Images LSM confocales d'argile montmorillonite avec l'ester Atto 550 NHS (longueur d'onde d'excitation 561 nm, puissance laser 0,012 mW, lumière-montmorillonite, obscurité-eau) (a) ; images cryo-SEM de la surface (limite air/argile) de l'argile montmorillonite, les images du bas montrent une similitude (angles aigus marqués par des pointillés) entre les structures observées par les techniques cryo-SEM (gauche) et confocale LSM (droite) (b) sur limites argile montmorillonite/air et argile montmorillonite/verre.

Dans la continuité de l'étude, des solutions d'eau ultrapure et de NaCl (0, 2 à 20% en poids) ont été étudiées à l'aide de la technique cryo-SEM. L'eau ultrapure a révélé une surface pointillée homogène (Fig. S3, première rangée), tandis que la solution de NaCl (0, 2% en poids) a révélé des structures lamellaires discontinues à parois minces; la distance entre les lamelles était de 10 ± 2 µm. À une concentration de NaCl de 0,8 et 0,9 % en poids, les parois des lamelles sont devenues plus épaisses et plus continues. Les structures lamellaires forment des domaines qui sont orientés à des angles différents les uns par rapport aux autres. Lorsque les concentrations de NaCl étaient comprises entre 1, 1 et 1, 5% en poids, les ponts entre les lamelles sont apparus, transformant la structure lamellaire en cellule. Ici, l'épaisseur de paroi a augmenté et une pluralité de trous dans les parois a encore été observée. Aux concentrations de NaCl de 2,0 et 5,0 % en poids, la microstructure est devenue complètement semblable à une cellule. Les éléments cellulaires sont allongés, leur dimension transversale est d'environ 10 ± 2 µm. Aux concentrations de NaCl de 10, 0 et 20, 0% en poids, la taille des éléments de type cellulaire a diminué (dimension transversale 5 à 8 µm) et l'épaisseur de la paroi a encore augmenté. Les dimensions longitudinales et transversales des cellules élémentaires se sont approchées (Fig. S3). Une caractéristique telle que des microtrous dans les parois a été remarquée pour les solutions de NaCl dans une plage de concentration de 0,8 à 2,0 % en poids (Fig. S4). La présence de microtrous (0,5 à 2,0 µm de diamètre) peut être prescrite aux bulles d'air ou considérée comme une caractéristique spécifique qui assure la continuité des parois de la microstructure.

La cartographie élémentaire Cryo-SEM a indiqué que les éléments Na et Cl étaient principalement positionnés dans les parois de la microstructure, tandis que O (à partir de H2O) - entre les parois (Fig. 8a). Les éléments Na et Cl sont situés principalement dans les parois de la microstructure (la distribution homogène de l'élément Pt utilisé pour la pulvérisation plasma a indiqué que les éléments microstructuraux ne recouvraient pas la surface de l'échantillon affectant le flux d'électrons). Une étude détaillée (à l'échelle nanométrique) de la structure de ces parois a montré qu'elles sont constituées de structures arrondies < 50 nm de taille (Fig. 8b) (les mesures cryo-SEM EDS "au point" pour les sphères observées n'ont pas été effectuées en raison de la technique limitation : à un grossissement aussi élevé (× 100 000), l'énergie du faisceau d'électrons fond et détruit la zone d'analyse pendant le temps (~ 30 s) nécessaire pour collecter le spectre EDS). Pour les solutions de NaCl dans une plage de concentration de 0,2 à 5,0 % en poids, les structures arrondies sont empilées de manière aléatoire pour former des parois de solvatation, alors qu'à des concentrations de 10,0 ou 20,0 % en poids, elles forment des fils allongés (~ 100 nm d'épaisseur, ≤ 3 µm de longueur), qui, à leur tour, sont organisés en motifs complexes formant les parois de la microstructure de type cellulaire. Les images Cryo-SEM de solutions de NaCl à l'échelle microscopique démontrent une microstructure volumétrique complexe qui, avec une concentration accrue, se transforme d'une structure lamellaire discontinue (à 0,2–1,5 % en poids) en une structure de type cellulaire (à 2,0–20,0 % en poids) (Fig. S5, S6). La microstructure tridimensionnelle (3D) des solutions de NaCl peut être décrite comme une quantité de domaines orientés différemment d'éléments agrégés de type cellulaire. La taille des domaines est d'environ 100 à 500 µm dans chaque dimension. L'épaisseur des parois de solvatation augmente avec la concentration de NaCl. Une étude détaillée de cette fonctionnalité est présentée dans la Fig. S7 supplémentaire, Tableau S1-S3.

Cartographie élémentaire Cryo-SEM EDS d'une solution de NaCl à 10 % en poids : distribution élémentaire de Na, Cl, O et Pt. Le Pt a été utilisé pour la pulvérisation plasma, sa distribution homogène indique que les éléments microstructuraux de l'échantillon n'ont pas dépassé la surface influençant le flux d'électrons (a). Images Cryo-SEM de solutions de NaCl (0,8 à 20 % en poids) : microstructure à l'échelle nanométrique (b).

Une autre caractéristique intéressante remarquée était la déviation des concentrations atomiques de Na et de Cl par rapport au rapport stœchiométrique : la quantité d'atomes de Na ou de Cl prévalait en fonction de la zone analysée. Dans certaines zones analysées, le rapport entre les atomes de Na et de Cl était de 1 : 1,88. Une disproportion entre les distributions d'atomes de Na et de Cl a été observée sur des zones comprises entre 475 et 1230 µm2 (environ 43,1 ∙ 10−6 mm3, pénétration des rayons X ~ 3,5 µm). Une telle inhomogénéité peut entraîner une prédominance locale de certaines réactions entraînant la formation de composés acides ou basiques tels que HClO, NaOH, etc. Cette conclusion est en corrélation avec des études antérieures dans lesquelles l'inhomogénéité du pH à l'échelle microscopique des solutions de NaCl congelées a été confirmée23,24. En particulier, l'existence d'un gradient de pH ∆pH = 0,2 à l'intérieur des parois de solvatation dans la solution de NaCl 20 mM congelée a été détectée à l'aide de la microscopie à fluorescence ratiométrique23. Une autre étude a montré que les processus de congélation et de décongélation en présence de NaCl pouvaient modifier considérablement la valeur du pH, entraînant la décomposition de l'acide gallique24.

On peut supposer que la microstructure hautement ordonnée observée des solutions de NaCl reflète un état proche de la réalité, c'est-à-dire que la microstructure dynamique des amas d'eau pure et des ions Na+ et Cl− solvatés densément emballés est une caractéristique inhérente de ce système. Cette supposition peut être utile pour comprendre, par exemple, les anomalies électrolytiques.

Il est généralement admis que l'eau est un liquide hautement structuré en raison d'un vaste réseau de liaisons hydrogène ; cependant, il n'y a pas d'accord sur la façon dont la structure doit être définie25,26. Au cours des dernières années, il a été découvert que les molécules d'eau peuvent former différents types de structures, par exemple des dimères, des tétramères, des hexamères et des nanoclusters27. De telles structures d'eau ont été visualisées sur des surfaces 2D (sur des films de NaCl(001) supportés par une bicouche Au(111), NaCl(100) sur des surfaces Ag(111), Cu(110), etc.)27,28,29 ,30,31. En particulier, on a constaté que l'eau s'agrégeait en divers amas avec la dominante de dimères d'eau sur une surface Cd(0001)27. Fait intéressant, les nanoflakes de glace amorphe ont été construits exclusivement à partir de dimères d'eau. Il a été démontré que la stabilité ultra élevée des dimères d'eau résulte de l'amélioration induite par l'adsorption du moment dipolaire de l'eau27. Dans les solutions salines, deux types de molécules d'eau coexistent : sans interaction et en interaction directe avec les ions formant une enveloppe d'hydratation dynamique (couches de solvate)25,26. La structure de l'eau dans les couches de solvate s'est avérée différente de celle de l'eau sans interaction, révélant des propriétés différentes (par exemple, avoir une densité moyenne supérieure à celle de l'eau pure)26,32. Les ions hydratés peuvent être considérés comme des sphères rigides à l'échelle de la picoseconde, de sorte que la solution peut être imaginée comme de l'eau liquide en vrac avec des sphères en suspension33. Ici, la modification des propriétés macroscopiques des solutions (par exemple, l'augmentation de la viscosité) était généralement liée à la modification de la structure des liaisons hydrogène de l'eau pure34,35. Cependant, les mesures du temps de corrélation orientationnelle des molécules d'eau dans des solutions hautement concentrées de Mg(ClO4)2, NaClO4 et Na2SO4 au moyen de la spectroscopie pompe-sonde femtoseconde ont révélé que l'ajout d'ions n'avait aucune influence sur la dynamique de rotation des molécules d'eau à l'extérieur. les premières couches de solvatation des ions33. Les résultats obtenus pour l'eau pure et les solutions hautement concentrées de NaClO4, Na2SO4 ont montré que la décroissance de l'anisotropie des groupes OH liés à l'eau n'était pas affectée par la présence de fortes concentrations d'ions ClO4−, SO42− et/ou Na+. Cela indique que, même dans des solutions salines hautement concentrées, les ions avec des coquilles de solvatation coexistent avec de l'eau pure en vrac, ce qui est en corrélation avec nos résultats. De plus, la formation d'amas ordonnés de particules a été visualisée le long de la direction d'écoulement dans les dispersions et interprétée comme l'origine de l'épaississement par cisaillement dans les dispersions colloïdales36.

Dans cette étude, la microstructure de systèmes aqueux stables a été étudiée à l'aide de techniques cryo-SEM et LSM confocales. Les résultats ont montré une concordance des caractéristiques structurelles observées par les mesures cryo-SEM et LSM confocales pour le gel d'agar, les argiles minérales (montmorillonite et kaolin) et les hydrocolloïdes de NP. En particulier, pour le gel d'agar, ces caractéristiques de microstructure communes étaient des structures volumétriques avec des formes irrégulières de 20 à 400 µm, des structures en couches, des structures allongées et poreuses hautement ordonnées. Pour les NP MAg, une caractéristique commune était des formes arrondies de 20 à 100 µm. Pour l'argile de kaolin, une caractéristique était l'alignement parallèle des microplaques de kaolin, alors que pour l'argile de montmorillonite, il s'agissait d'une microstructure spongieuse poreuse. Outre les caractéristiques similaires observées entre les résultats des deux techniques utilisées, il y avait également des différences, telles que l'incohérence de la vue générale et de la dimension de la microstructure. Ce dernier peut être prescrit aux différentes zones d'observation de l'échantillon pendant les mesures : au cryo-SEM, une structure en vrac est observée (due à la fracturation de l'échantillon), alors qu'à l'étude confocale LSM, une couche mince (quelques micromètres) près de la surface du verre a été étudiée ( par exemple, à 1 AU, la profondeur est d'environ 1 µm) (schéma de la Fig. 9a). Comme on le sait, la microstructure en vrac diffère considérablement de la couche de surface. La figure 9b présente les exemples de transition d'échelle de microstructure survenue dans un gel de polysaccharide (limite air/gel), de la masse à la surface en passant par la couche intermédiaire. La transition d'échelle peut aller d'une microstructure grossière dans la masse à une échelle fine en surface et, inversement, de la fine échelle dans la masse à une échelle grossière en surface (Fig. 9b)37. Ces observations indiquent que les résultats des mesures LSM confocales de systèmes non biologiques contenant de l'eau (c'est-à-dire sans limites prononcées dans l'eau) dépendent fortement de l'interaction verre/échantillon (affinité entre eux, mouillabilité, etc.). Cette conclusion est également étayée par nos résultats de mesures LSM confocales de l'argile montmorillonite avec Atto 550 NHS décrites ci-dessus. L'argile montmorillonite avec ce colorant fluorescent a révélé des structures hautement parallèles prescrites pour améliorer l'affinité entre l'argile et la surface du verre (à titre de comparaison, l'argile montmorillonite avec de la fluorescéine n'a révélé que des structures spongieuses poreuses). Ainsi, la microstructure de la couche proche de la surface (substrat/échantillon, air/échantillon) diffère considérablement en échelle et en motif de celle de la masse.

Schéma d'observation de l'échantillon aux mesures confocales LSM et cryo-SEM (a); exemples de transfert d'échelle de microstructure à travers des couches de transition (entourées d'une ligne pointillée), de la surface à la masse, dans le gel de polysaccharide à la limite air/gel37 (b) ; schéma de microstructure de solvatation dynamique (c).

La corrélation entre les mesures cryo-SEM et LSM confocales de systèmes stables contenant de l'eau (agar, kaolin, montmorillonite, MAg NPs) a permis de conclure que la microstructure ordonnée est une caractéristique inhérente à ces systèmes. On suppose que les solutions de NaCl peuvent également posséder une microstructure ordonnée dynamique (niveau femtoseconde) constituée d'amas d'eau pure et d'ions Na + et Cl− solvatés densément emballés (schéma proposé à la Fig. 9c). La supposition sur l'existence de la microstructure peut aider à comprendre les propriétés anormales (par exemple, la densité, la viscosité, le pH) de certains systèmes aqueux (électrolytes, dispersions, etc.).

Les réactifs de qualité analytique de gélose (CAS 9002-18-0, A1296), kaolin (CAS 1332-58-7), montmorillonite (CAS 1318-93-0), rhodamine B (CAS 81-88-9), fluorescéine ( acide libre) (CAS 2321-07-5), CaCl2∙2H2O (CAS 10035-04-8), colorant de fluorescence Atto 550 NHS ester (MFCD05865403), diméthylsulfoxyde (DMSO) (CAS 67-68-5) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et utilisé tel que reçu. Du chlorure de sodium pur à 99,9 % (CAS 7647-14-5), de l'hydroxyde d'ammonium (CAS 1310-73-2) ont été achetés auprès de POCH SA De l'eau ultrapure (résistivité > 17 MΩcm) provenant d'un système d'eau GZY-P10 a été utilisée tout au long des expériences. Pour les mesures cryo-SEM, de l'eau filtrée stérile ultrapure déminéralisée (CAS 7732-8-5, Sigma-Aldrich) a été utilisée. Des lames de verre 24 × 50 mm (Menzel Gläser) et 18 × 18 mm (Zeiss) et un joint en caoutchouc (joint torique, 13 × 1 mm) ont été utilisés pour les mesures LSM confocales.

L'hydrocolloïde de NP ultrapetites d'oxyde de fer et d'argent (MAg) dont la préparation, la caractérisation physicochimique et biologique ont été fournies21, a été utilisé dans cette étude. Les hydrocolloïdes MAg NPs sont capables de former des dispersions aqueuses stables, et à forte concentration (≥ 37 mg/ml), des gels colloïdaux. Dans cette étude, le colorant fluorescent rhodamine B a été ajouté à l'hydrocolloïde MAg (concentration d'hydrocolloïde : NPs-38,2 mg/ml, rhodamine B-49,2 µg/ml) afin d'améliorer le contraste lors de l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) (pour appliquer une puissance laser ultrafaible qui minimise le chauffage de l'échantillon et l'évaporation de l'eau pendant les mesures). La concentration de rhodamine B dans l'hydrocolloïde MAg était de 49,2 µg/ml. Après addition de rhodamine B, l'hydrocolloïde MAg a été vortexé et stocké dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à son utilisation.

Pour préparer un gel d'agar (5 % en poids) avec de la rhodamine B, une solution de rhodamine B (100 µl, 2,95 mg/ml) a été mélangée avec 4900 µl d'eau et combinée avec de la poudre d'agar (250 mg). La concentration de rhodamine B dans le gel d'agar était de 59 ug/ml. Pour résoudre l'agar, un verre thermorésistant avec le mélange préparé a été mis au four à micro-ondes pendant quelques minutes en évitant l'ébullition. Le gel rigide et transparent refroidi a été stocké dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à son utilisation.

Pour préparer l'argile de kaolin (27,5% en poids), 1,5 g de poudre de kaolin ont été mélangés avec 5000 µl d'eau, puis 1,6 mg de fluorescéine, 150 µl de NaOH 5 M, 300 µl de CaCl2 ∙2H2O (5% en poids), mélangé, soniqué pendant 2 h et laissé dans l'obscurité à température ambiante pendant 48 h. La concentration de fluorescéine dans l'argile de kaolin était de 293,5 µg/ml. L'argile de kaolin préparée a été stockée dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à son utilisation.

Pour préparer l'argile montmorillonite (30% en poids), 1,5 g de poudre de montmorillonite ont été mélangés avec 4550 µl d'eau, puis 1,6 mg de fluorescéine, 150 µl de NaOH 5 M, 300 µl de CaCl2 ∙2H2O 5% en poids ont été ajoutés, mélangés, soniqué pendant 2 h et laissé dans l'obscurité à température ambiante pendant 48 h. La concentration de fluorescéine dans l'argile montmorillonite était de 320 µg/ml. L'argile montmorillonite préparée a été stockée dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à son utilisation.

Pour préparer l'argile montmorillonite avec le colorant fluorescent Atto 550 NHS ester, 1 µl de solution mère de colorant (1 mg/100 µl de DMSO) a été dilué dans 1 ml d'eau. Ensuite, 200 µl de cette solution ont été mélangés avec 300 µl d'eau, 150 mg de poudre de montmorillonite, 10 µl de CaCl2 ∙2H2O à 5 % en poids, 10 µl de NaOH 5 M. La concentration d'ester Atto 550 NHS dans l'argile montmorillonite était de 3,85 ug/ml. L'argile montmorillonite préparée a été stockée dans l'obscurité à 4 ° C pendant 48 h avant les mesures.

Des solutions de chlorure de sodium (0,2 à 20 % en poids) ont été préparées avec de l'eau ultra pure.

Les mesures Cryo-SEM ont été effectuées à l'aide d'un microscope électronique à balayage JEOL 7001F équipé d'un système Cryo PP3000T fabriqué par Quorum Technologies (qui comprend une platine froide SEM, un anti-contaminant, une chambre de préparation montée sur colonne, un bureau de préparation d'échantillons PrepDek, une pile de pompage turbo et un système de refroidissement à gaz froid CHE3000 ). Le système Cryo PP3000T utilise la méthode de congélation par plongée à l'azote pour une congélation rapide des échantillons. L'azote liquide gèle à 63 K (− 210 ° C) dans une large gamme de valeurs de pression. En plongeant un objet dans de l'azote bouilli, on obtient un refroidissement plus rapide qu'en plongeant dans de l'azote liquide à son point d'ébullition (‒196 °C). La vitesse de refroidissement élevée empêche la croissance des cristaux de glace en les fixant à l'étape de nucléation (taille nm sévère). la préparation et la manipulation des échantillons et l'électronique de contrôle. Les échantillons liquides ont été placés sous forme de goutte (~ 30 µl), le gel d'agar sous forme de paix dans un trou du bout d'échantillon de sorte qu'il dépasse au-dessus de la surface et monté sur une navette. Après la congélation, l'échantillon a été transféré dans la chambre de préparation montée sur colonne à l'aide d'un dispositif de transfert cryogénique qui lui permet d'être stocké sous vide en le gardant propre et sans humidité. La chambre de préparation équipée de grandes surfaces froides fournit les installations pour fracturer, sublimer et pulvériser le revêtement plasma de l'échantillon. Dans la chambre de préparation, la température de la phase froide a été maintenue à environ ‒185 °C (lors de la fracturation et de la pulvérisation de l'échantillon) avec une stabilité de 1 °C, et le vide de la chambre était de l'ordre de 8,5·10–4 Pa. Sublimation (gravure à la glace ) a été réalisée à ‒90 °C ; la durée variait selon le spécimen et était choisie expérimentalement (généralement entre 5 et 50 min) sauf indication contraire. Le revêtement par pulvérisation de plasma a été réalisé à l'aide d'une cible de Pt. De la chambre de préparation, l'échantillon a ensuite été transféré dans la chambre SEM pour observation. À l'intérieur du microscope électronique se trouve une platine froide qui maintient les échantillons congelés pendant l'observation. La température de la platine froide du microscope électronique a été maintenue à ‒190 ± 2 °C (niveau de vide ~ 2,6·10–5 Pa). Des images électroniques secondaires de l'échantillon congelé ont été acquises à 5 keV. L'analyse de dispersion d'énergie (EDS) a été réalisée au moyen d'un détecteur de dérive au silicium SDD à grande surface X-Max 80 mm2 (Oxford Instruments) à 15 keV. La mesure Cryo-SEM des solutions de NaCl a été réalisée à l'aide d'un bout d'échantillon pulvérisé d'or, la durée de la sublimation était de 30 à 60 min à ‒ 90 ° C; le temps de sublimation pour l'analyse cryo-SEM EDS a été réduit à 10–15 min (pour maintenir la surface de l'échantillon à plat).

L'imagerie du gel d'agar, des argiles minérales et de l'hydrocolloïde de NP à température ambiante (sans congélation) a été réalisée à l'aide d'un LSM confocal Zeiss LSM 780 équipé d'un laser infrarouge accordable femtoseconde pour une excitation à deux photons. Le spécimen (30 µl ou morceau de gel de 4 × 4 mm) a été placé sur une lame de verre (24 × 50 mm), avec un joint en caoutchouc (joint torique 13 × 1 mm) sur le dessus, à l'intérieur du joint en caoutchouc (pour garder échantillon volumétrique lors de la mesure ; épaisseur d'un tampon en caoutchouc ≈ épaisseur de l'échantillon) et recouvert d'une autre lame de verre (18 × 18 mm) (pour réduire l'évaporation de l'eau lors des mesures) (voir Fig. 2a). Les mesures de tous les échantillons ont été effectuées à l'aide d'un objectif C-Apochromat 40x/1,20 W Corr M27 (ouverture numérique 1,2) à faible puissance laser (< 1 % de la puissance laser nominale ; pour réduire l'évaporation de l'eau et les changements induits par le laser dans l'échantillon) , gain 830. Le mode de moyenne de ligne a été appliqué pour l'enregistrement d'images. La concentration de rhodamine B, de fluorescéine et de colorants de fluorescence Atto 550 NHS dans les échantillons a été mentionnée ci-dessus, dans la section "Préparation des solutions et des dispersions". Le gel d'agar avec de la rhodamine B a été mesuré à une longueur d'onde d'excitation laser de 561 nm et une plage d'émission de 585 à 735 nm. L'hydrocolloïde de MAg NPs avec de la rhodamine B a été mesuré à une longueur d'onde d'excitation de 514 nm, une émission de 536 à 674 nm et un mode de réflexion. Les images en 2,5 dimensions (2,5D) (axes x, y, intensité) ont été obtenues en utilisant une technique de traitement qui permet de fusionner deux images. Les mesures des argiles de kaolin et de montmorillonite avec de la fluorescéine ont été effectuées à une excitation de 405 nm et l'émission a été enregistrée dans la plage de 416 à 493 nm. L'argile montmorillonite avec l'ester Atto 550 NHS a été déposée entre une lame de verre et une lamelle couvre-objet (sans joint en caoutchouc) et mesurée à une longueur d'onde d'excitation de 561 nm, émission de 571 à 670 nm. Toutes les images ont été enregistrées près de la surface de la lame de verre.

Toutes les données générées et analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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Le soutien financier a été fourni par le Centre NanoBioMedical, Université Adam Mickiewicz, Poznań, Pologne. Le financement des coûts de publication en libre accès a été assuré par le programme ID-UB de l'Université Adam Mickiewicz, Poznań, Pologne. L'auteur est très reconnaissant au Dr Barbara Peplińska pour sa collaboration et l'enseignement de la microscopie électronique à balayage cryogénique, des discussions fructueuses, des commentaires, la relecture et l'édition d'articles. L'auteur tient également à remercier le Dr Bartosz Grzeszkowiak et le Dr Weronika Andrzejewska pour le colorant fluorescent Atto et l'eau ultra pure qu'ils ont gracieusement offert.

Centre NanoBioMedical, Université Adam Mickiewicz, 61-614, Poznań, Pologne

Olena Ivashchenko

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OI a écrit le texte principal du manuscrit, préparé des figures, effectué des mesures.

Correspondance à Olena Ivashchenko.

L'auteur ne déclare aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ivashchenko, O. Études Cryo-SEM et LSM confocales du gel d'agar, de l'hydrocolloïde de nanoparticules, des argiles minérales et des solutions salines. Sci Rep 12, 9930 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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Reçu : 18 mars 2022

Accepté : 02 juin 2022

Publié: 15 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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