Le rôle méconnu d'un précurseur de la biotine pour les bactéries marines

The ISME Journal volume 16, pages 2599–2609 (2022)Citer cet article

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La biotine (vitamine B7) est impliquée dans un large éventail de réactions biochimiques essentielles et un micronutriment crucial qui est vital pour de nombreux organismes pro- et eucaryotes. Les quelques mesures de biotine dans les océans du monde montrent que la disponibilité est sujette à de fortes fluctuations. De nombreux micro-organismes marins présentent une auxotrophie de la biotine et dépendent donc de l'apport d'autres organismes. La desthiobiotine est le principal précurseur de la biotine et a récemment été détectée à des concentrations similaires à la biotine dans l'eau de mer. La dernière réaction enzymatique dans la voie de biosynthèse de la biotine convertit la desthiobiotine en biotine via la biotine synthase (BioB). Le rôle de la desthiobiotine en tant que précurseur de la synthèse de la biotine dans les systèmes microbiens est cependant largement inconnu. Ici, nous démontrons expérimentalement que les bactéries peuvent surmonter l'auxotrophie de la biotine si elles conservent le gène bioB et que la desthiobiotine est disponible. Une recherche génomique de 1068 bactéries prédit que le potentiel de biosynthèse de la biotine varie considérablement entre les différents groupes phylogénétiques et que 20% codent uniquement bioB et peuvent donc potentiellement surmonter l'auxotrophie de la biotine. De nombreuses actino- et alphaprotéobactéries ne peuvent pas synthétiser la biotine de novo, mais certaines possèdent uniquement bioB, alors que la grande majorité des gammaprotéobactéries et des flavobactéries présentent les quatre derniers gènes cruciaux de synthèse de la biotine. Nous avons détecté des concentrations intra- et extracellulaires élevées du précurseur par rapport à la biotine dans la bactérie prototrophe Vibrio campbellii, la desthiobiotine extracellulaire atteignant jusqu'à 1,09 ± 0,15*106 molécules par cellule au cours d'une croissance exponentielle. Nos résultats fournissent des preuves du rôle écologique de la desthiobiotine comme voie d'évacuation pour surmonter l'auxotrophie de la biotine pour les bactéries dans l'océan et vraisemblablement dans d'autres écosystèmes.

La biotine (vitamine B7) est une coenzyme essentielle impliquée dans de nombreuses réactions biochimiques chez les procaryotes et les eucaryotes. Les enzymes dépendantes de la biotine catalysent les réactions de carboxylation, telles que la pyruvate carboxylase, la propionyl-CoA carboxylase, l'acétyl-CoA carboxylase ou la β-méthylcrotonyl-CoA carboxylase. Ces réactions indispensables sont impliquées dans la gluconéogenèse, la synthèse des acides gras et le catabolisme des acides aminés [1,2,3]. Deux carboxylases biotine-dépendantes supplémentaires peuvent être trouvées dans les bactéries, l'urée amidolyase, qui permet aux bactéries d'utiliser l'urée comme source d'azote, et la géranyl-CoA carboxylase, qui est impliquée dans le catabolisme des isoprénoïdes [4]. La base de la voie de biosynthèse de la biotine est la synthèse de pimeloyl-CoA qui peut être obtenue par différentes voies métaboliques [4] suivie de l'activité séquentielle de quatre enzymes, la 8-amino-7-oxononanoate synthase (BioF), l'adénosylméthionine-8- amino-7-oxononanoate aminotransférase (BioA), desthiobiotine synthase (BioD) et biotine synthase (BioB), qui convertissent le pimeloyl-CoA en biotine [5, 6]. La réaction enzymatique finale implique l'insertion d'un atome de soufre entre les positions saturées C6 et C9 de la desthiobiotine, qui proviendrait de la cystéine [7] (Fig. 1). Les estimations actuelles, basées sur des expériences de culture, suggèrent que 90 % de tout le phytoplancton eucaryote sont des prototrophes de biotine [8,9,10]. Malgré l'importance de la biotine et l'accessibilité des génomes bactériens pour l'évaluation des voies métaboliques, le potentiel de biosynthèse de la biotine chez les bactéries marines est resté largement insaisissable. Dans des études antérieures, seul bioB, le gène codant pour la conversion finale de la desthiobiotine en biotine, a été pris en compte pour la classification du potentiel de la voie biotine des bactéries marines. Ces analyses suggèrent que plusieurs représentants marins des Alphaprotéobactéries et des Flavobactéries sont incapables de synthétiser la biotine, alors que la plupart des Gammaprotéobactéries marines sont des prototrophes de la biotine [10]. Cependant, les évaluations du potentiel de la voie de la biotine des communautés bactériennes en tenant compte des quatre gènes de la voie de la biotine, par exemple dans l'intestin humain, montrent qu'un grand nombre de bactéries présentent des auxotrophes de la biotine, mais la récupération des précurseurs de la biotine pourrait jouer un rôle important [11].

La voie de biosynthèse de la biotine est illustrée dans les bactéries. Les réactions enzymatiques individuelles avec les produits de synthèse résultants sont indiquées.

Au cours des dernières décennies, des découvertes de grande envergure ont été faites dans l'étude des vitamines B dans les océans. Des recherches approfondies sur les coenzymes thiamine et cobalamine ont montré que non seulement l'échange du cofacteur final est important [12], mais aussi l'alimentation croisée de vitamères (composés structurellement liés à une vitamine qui incluent des précurseurs biosynthétiques ou des produits de dégradation) semblent avoir une pertinence jusqu'alors sous-estimée pour le cycle de la vitamine B marine [13,14,15,16,17]. Des interactions microbiennes étroites impliquant l'échange obligatoire de biotine et de métabolites biosynthétiques entre le plancton marin ont également récemment mis en évidence l'importance de la biotine pour les communautés microbiennes marines [18,19,20]. La recherche sur l'alimentation croisée de la biotine vitamère dans les écosystèmes marins en est encore à ses balbutiements, même si les premiers résultats passionnants ont été obtenus il y a plusieurs décennies [21,22,23,24]. Plusieurs études ont démontré que les isolats fongiques et bactériens peuvent surmonter leur auxotrophie de la biotine lorsque la desthiobiotine est fournie. Cependant, les concentrations auxquelles des effets ont été observés étaient disproportionnellement élevées et ne reflétaient pas les conditions naturelles [21,22,23,24]. De plus, des concentrations élevées de desthiobiotine ont montré une croissance inhibée pour certaines bactéries et une suppression de l'absorption de biotine pour d'autres [23,24,25]. Ce qui était caché aux scientifiques à l'époque (début des années 1940), mais qui est connu aujourd'hui, ce sont des connaissances enzymatiques et génétiques sur la voie de biosynthèse de la biotine pour placer ces découvertes dans un contexte écologique adéquat. En effet, on sait aujourd'hui que la desthiobiotine est le précurseur métabolique de la biotine et que sa conversion nécessite l'enzyme BioB. Pourtant, la cause et la fréquence de l'utilisation de la desthiobiotine, ainsi que ses sources naturelles et sa disponibilité, sont largement inconnues. Dans les quelques cas où la desthiobiotine a été mesurée le long d'un transect dans l'océan Atlantique et au niveau des bouches hydrothermales en haute mer de la dorsale du Pacifique Est, les concentrations dépassaient en partie celles de la biotine, et les concentrations les plus élevées mesurées à ce jour étaient d'environ 100 pM à un niveau profond. cheminée hydrothermale marine [26, 27]. Les quelques mesures de biotine dissoute dans l'eau de mer ont montré de fortes fluctuations du cofacteur final avec des valeurs comprises entre en dessous de la limite de détection (<1,2 pM) et jusqu'à 700 pM [27,28,29,30,31].

Nous émettons l'hypothèse que la desthiobiotine a un rôle important encore non reconnu pour surmonter l'auxotrophie de la biotine dans les communautés microbiennes marines. Par conséquent, nous nous sommes demandé dans quelle mesure l'absence d'une voie de la biotine, et donc probablement l'auxotrophie de la biotine, est répandue chez les bactéries marines et dans quelle mesure la disponibilité de la desthiobiotine contribue à surmonter l'auxotrophie. Notre objectif était de déterminer les sources naturelles et la disponibilité environnementale du précurseur de biotine actuellement largement inconnu. Nous avons également cherché à mieux comprendre comment l'absorption bactérienne et la transformation de la desthiobiotine peuvent affecter d'autres micro-organismes auxotrophes dans l'environnement.

Pour tester si et dans quelle mesure l'apport de desthiobiotine permet aux bactéries de surmonter leur auxotrophie à la biotine, nous avons criblé plusieurs bactéries du groupe Roseobacter, qui devraient englober des organismes auxotrophes à la biotine ainsi que des organismes prototrophes [32]. Dans des expériences de co-culture phytoplancton-bactéries, nous avons cherché à savoir si des bactéries auxotrophes à la biotine capables de convertir la desthiobiotine en biotine pouvaient partager le cofacteur final avec des micro-organismes ambiants. En utilisant la génomique et la métagénomique comparatives, nous avons étudié la distribution des gènes de la voie de la biotine parmi les bactéries marines. Nous avons pu mieux comprendre le potentiel de biosynthèse de la biotine des communautés procaryotes proches de la surface dans un transect latitudinal à travers l'océan Atlantique entre les régions de température subantarctique et nordique. À l'aide de la spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie liquide haute performance (LC-MS), nous avons identifié une source naturelle du précurseur de la biotine, la desthiobiotine. Nos résultats fournissent un nouvel aperçu du cycle de la biotine marine, identifiant la desthiobiotine comme une alternative efficace pour de nombreuses bactéries auxotrophes à la biotine souffrant d'une carence en biotine et soulignant le rôle critique des vitamines B pour les interactions microbiennes.

Des représentants bactériens séquencés du génome du groupe Roseobacter ont été criblés pour la présence de la voie de biosynthèse de la biotine. Pour nos études expérimentales sur la croissance, nous avons sélectionné 6 organismes modèles dépourvus des gènes codant pour les quatre dernières réactions enzymatiques de la voie de la biotine (bioF, bioA, bioD, bioB ; Pacificibacter marinus DSM 25228, Sedimimonas qiaohouensis DSM 21189, Sulfitobacter sp. DFL- 14) ou ne possèdent que le gène de la dernière réaction enzymatique de la voie de la biotine (bioB ; Celeribacter indicus DSM 27257, Roseovarius mucosus DSM 17069, Sulfitobacter sp. EE-36 DSM 11700). Les souches ont d'abord été cultivées sur un milieu de bouillon marin (MB), puis lavées trois fois (centrifugées à 5000 g) et remises en suspension dans un milieu d'eau de mer artificielle (ASW) (sans biotine). Les cultures ont ensuite été cultivées dans un milieu ASW uniquement additionné de thiamine (vitamine B1), de riboflavine (vitamine B2), d'acide nicotinique (vitamine B3), d'acide pantothénique (vitamine B5), de chlorhydrate de pyridoxine (vitamine B6) et de cobalamine (vitamine B6). B12 ; chacune à 500 pM) pour contrer d'éventuelles autres auxotrophies vitaminiques et complétée par un mélange de substrats (30 mM C), à parts égales (mM C) constitué de glucose, d'acétate et de glutamate. Les bactéries ont été cultivées dans 10 ml de milieu dans des tubes à essai en verre triple à pH 8 et 20 ° C dans l'obscurité sur un agitateur (100 tr / min), avec des ajouts individuels de desthiobiotine et de biotine, 1 nM chacun, et un contrôle négatif sans autre ajout . Des tubes à essai stériles en triple contenant le milieu et la source de carbone respective ont été utilisés comme contrôle. La croissance a été suivie par densité optique (OD600).

En tant qu'organisme modèle pour un eucaryote auxotrophe, unicellulaire et phototrophe à la biotine, le dinoflagellé axénique Prorocentrum minimum (CCMP 1329) a été cultivé dans un milieu d'eau de mer traitée au charbon (mer du Nord) avec des ajustements mineurs. Le milieu SW traité au charbon de bois a été généré comme suit. Au SW préfiltré (0,2 µm), 10 g de charbon actif par litre ont été ajoutés et secoués pendant 30 min. Ensuite, le charbon de bois avec les composés organiques liés a été retiré du SW par filtration avec un filtre de dessus de bouteille (Rapid Flow Bottle Top Filter 0,2 µm, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Le SW traité au charbon de bois a été complété avec du NaNO3 (882 µM), du NaH2PO4 (36,2 µM) et des métaux traces comme décrit pour le milieu F/2 [33], mais sans addition de silicate. Le milieu a été rincé au CO2 pendant 1 min avant l'autoclavage. De la thiamine (vitamine B1), de la riboflavine (vitamine B2), de l'acide nicotinique (vitamine B3), de l'acide pantothénique (vitamine B5), du chlorhydrate de pyridoxine (vitamine B6) et de la cobalamine (vitamine B12 ; chacun à une concentration finale de 500 pM) ont été ajoutés au milieu pour contrer d'éventuelles autres auxotrophies vitaminiques. Afin de maintenir une culture minimale de P. sans biotine, le dinoflagellé a été transféré 4 fois dans le milieu SW traité au charbon de bois jusqu'à ce que nous ne détections aucune croissance dans le contrôle négatif. La pré-culture pour l'expérience principale de P. minimum a été dopée avec 10 pM de biotine pour assurer une croissance minimale de P. minimum pour l'inoculation sans être une source de contamination par la biotine. Le dinoflagellé P. minimum a été cultivé dans un cycle lumière-obscurité de 12:12 h éclairé à 70 µE et incubé à 20 °C. Les cultures de l'expérience principale ont été cultivées en triple de 40 ml et additionnées de desthiobiotine ou de biotine (1 nM chacune) ou d'un témoin négatif sans autre ajout. Des tubes à essai stériles en triple contenant de l'eau de mer traitée au charbon de bois ont été utilisés comme témoins négatifs. L'axenicité des cultures de dinoflagellés a été vérifiée en colorant les cultures avec du Sybr Green et en les examinant au microscope pour les bactéries. La croissance a été suivie par fluorescence relative. Pour tester si une bactérie capable de convertir la desthiobiotine en biotine fournit à un autre organisme auxotrophe de la biotine le cofacteur essentiel et reçoit en retour du carbone organique, nous avons cultivé P. minimum et C. indicus en co-culture dans des conditions expérimentales variables. Initialement, nous avons cultivé la co-culture avec l'ajout de desthiobiotine (1 nM) et sans autres ajouts. Pour éliminer la possibilité que C. indicus ne puisse pas utiliser le carbone organique dérivé du dinoflagellé et ne puisse donc pas partager la biotine, dans un autre traitement, la co-culture a été complétée par un mélange de carbone organique (120 µM C), contenant du glucose, du glutamate et de l'acétate (chaque substrat à 40 µM C). De plus, nous avons ajouté de la biotine (1 nM) à la co-culture de bactéries et de dinoflagellés, pour nous assurer que la croissance du dinoflagellé n'était pas inhibée par C. indicus. Chaque expérience comprenait un témoin négatif, P. minimum cultivé sans addition de biotine, et un témoin positif, P. minimum cultivé avec addition de biotine 1 nM. Tous les traitements ont été exécutés en triple. Pour tous les traitements de co-cultures, l'inoculum bactérien initial a été calculé à 106 cellules ml-1.

Des échantillons pour le comptage des cellules bactériennes ont été prélevés pendant la phase de croissance stationnaire de P. minimum, surveillés par fluorescence relative. Pour le comptage des cellules bactériennes, les échantillons ont été fixés avec du glutardialdéhyde (GDA) à une concentration finale de 1 % et stockés à -20 °C jusqu'à une analyse plus approfondie. Avant le comptage par cytométrie en flux, les cellules bactériennes ont été détachées des cellules de dinoflagellés à l'aide de billes de verre (2,3 mm) et d'ultrasons (35 ° C, 70%, 4 × 5 min, Sonorex, Bandelin, Berlin, Allemagne), avec un court vortex étape (2 × 2 s, Vortex Genie2, Scientific Industries Inc., New York, États-Unis) après chaque intervalle ultrasonique. Cette méthode était un développement ultérieur de la méthode de détachement décrite ailleurs [34]. Par la suite, les échantillons ont été colorés avec du Sybr Green et comptés à l'aide d'un cytomètre en flux (BD Biosciences Accuri C6 ; BD Biosciences, Franklin Lakes NJ, États-Unis) comme décrit ailleurs [35].

Vibrio campbellii (DSM 19270) a d'abord été cultivé dans un milieu MB, transféré dans un milieu d'essai biologique autoinducteur (AB) comme décrit ailleurs [36] avec de légères modifications (ensemble de données supplémentaire 1) et lavé trois fois avec un milieu AB sans vitamine avant inoculation de l'expérience principale en milieu AB. Des cultures de 1400 ml ont été additionnées de glutamate (10 mM C) comme seule source de carbone et aucune vitamine n'a été ajoutée. La croissance a été surveillée par OD600 et en plus, des échantillons ont été prélevés stérilement pour le dénombrement des cellules bactériennes par cytométrie en flux. Les échantillons pour la cytométrie en flux ont été fixés avec du GDA à 2 %, incubés à 4 °C pendant 30 min et congelés à -20 °C jusqu'à l'analyse, comme décrit précédemment [35]. Des échantillons pour la détermination intra- et extracellulaire de la biotine et de la desthiobiotine ont été prélevés stérilement pendant la phase de croissance exponentielle moyenne et tardive, ainsi qu'au début de la phase stationnaire. Pour les analyses intracellulaires de la biotine et de la desthiobiotine, 50 ml de culture de V. campbellii ont été culottés par centrifugation (5000 g) et congelés à -20 ° C jusqu'à l'analyse. Pour les analyses extracellulaires de la biotine et de la desthiobiotine, 150 ml de culture ont été filtrés à travers un filtre de dessus de bouteille de 0, 22 µm (filtre de dessus de bouteille PES, Nalgene Thermo Scientific) et congelés à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

Des échantillons pour l'analyse de la biotine et de la desthiobiotine ont été prélevés lors d'une croisière en juillet 2019 dans la baie allemande (mer du Nord) sur le RV Senckenberg à 1 m sous la surface de la mer à trois stations d'échantillonnage différentes (échantillon 1 : 53°34'35"N, 8 °10'14"E ; échantillon 2 : 53°58'14"N, 8°36'55"E ; échantillon 3 : 54°45'38"N, 8°12'0"E ; échantillon 4 : 54° 35'13"N, 6°59'26"E) à l'aide de bouteilles de 5 l-Niskin attachées à une rosette CTD (Fig. S1A supplémentaire). Les échantillons d'eau ont été filtrés à bord (0,22 µm, mélange d'esters de cellulose, Millipore, Billerica, MA, USA) et conservés à 4 °C jusqu'à une analyse plus approfondie.

L'extraction de la biotine extracellulaire et de la desthiobiotine du milieu de culture et de l'eau de mer a été réalisée sur une colonne d'extraction en phase solide (Bond Elut PPL, 1 g, Agilent, Santa Clara, CA, USA), qui a été conditionnée avec 20 ml de méthanol et 20 ml de H2O (ajusté à pH 6 avec de l'acide chlorhydrique 37%). Des échantillons d'eau filtrée de la mer du Nord et des échantillons d'exométabolome bactérien ont été ajustés à pH 6 avec de l'acide chlorhydrique (37 %) et passés sur la colonne. Dix ml de H2O à pH 6 ont été utilisés pour laver le sel restant de la colonne et les analytes ont été élués avec 8 ml de méthanol. Le solvant a été évaporé sous un courant d'azote gazeux et les échantillons secs ont ensuite été traités comme décrit précédemment [37]. Pour l'extraction de la biotine et de la desthiobiotine intracellulaires, une version modifiée de la méthode décrite pour l'analyse des thioesters de la coenzyme A bactérienne a été appliquée [37]. Les culots cellulaires congelés ont été remis en suspension dans 1 ml de méthanol et brisés directement par homogénéisation dans un batteur à billes. De plus, l'extraction a été répétée deux fois avec 0,5 ml de méthanol et le solvant a été évaporé sous un courant d'azote gazeux. Toutes les autres étapes ont été effectuées comme décrit précédemment [37]. Tous les extraits filtrés ont été analysés sur un spectromètre de masse triple quadripôle TSQ Quantum AM (Thermo Fisher Scientific) avec ionisation électrospray chauffée en mode positif (HESI+). Les paramètres de la source étaient les suivants : tension de pulvérisation 3 000 V, température du vaporisateur 400 °C, température du tube de transfert 340 °C, gaz gaine 60 unités arbitraires, gaz auxiliaire 20 unités arbitraires. Les paramètres du mode de surveillance de la réaction sélectionné sont répertoriés dans les informations complémentaires (tableau supplémentaire S1). Une HPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) avec une colonne Kinetex Evo C18 (100 × 2,1 mm, taille des pores de 2,6 µm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) a été couplée au spectromètre de masse pour obtenir la séparation des analytes individuels. Le volume d'injection de chaque échantillon était de 5 µl et les éluants utilisés étaient du formiate d'ammonium 10 mM (pH 6,0 ; A) et de l'acétonitrile (B) avec le gradient de solvant suivant : 0–13 min 100-75 % A ; 13–15 min 75–0 % A ; 15–19 min 0 % A ; 19–21 min 0–100 % A ; 21–26 min 100 % A. La biotine et la desthiobiotine ont été quantifiées par étalonnage externe à l'aide de composés standard disponibles dans le commerce en combinaison avec des expériences de récupération sous l'influence de la matrice à l'aide d'échantillons d'eau de mer et de bactéries enrichis de biotine et de desthiobiotine et traités de la même manière. Voir la Fig. S2–5 supplémentaire pour des exemples de chromatogrammes et de spectres de fragments MS avec des signaux standard. Afin de tirer des conclusions plus précises sur le nombre de molécules de biotine ou de desthiobiotine libérées par V. campbellii à différents moments de la courbe de croissance, nous avons calculé les molécules détectées par cellule.

Les génomes accessibles au public ont été téléchargés à partir de la base de données Joint Genome Institute Integrated Microbial Genomes with Expert Review (consultée le 3 novembre 2021) (JGI/IMG/MER, https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/mer/main. cgi). La condition préalable au téléchargement des génomes était la catégorie d'écosystème "aquatique" et le statut de séquençage "ébauche permanente" ou "terminé". Afin de valider l'exhaustivité de tous les génomes, l'approche que nous avons appliquée était celle décrite dans (réf. [38]) avec de légères modifications. En bref, 55 copies de gènes domestiques uniques ont été recherchées dans tous les génomes [39, 40], après quoi nous avons supprimé tous les génomes qui avaient moins de 53 gènes domestiques, en appliquant une sélection rigoureuse. Plusieurs espèces attribuées ont été réduites à un seul génome, l'espèce avec le plus grand nombre de gènes domestiques a été sélectionnée comme représentative. Les souches attribuées à un genre mais pas à une espèce ont été considérées comme un groupe et réduites à un génome, qui a également été sélectionné en fonction du plus grand nombre de gènes domestiques. Nous avons vérifié manuellement la liste des espèces pour les doublons d'espèces.

Un total de 1710 génomes (61,6%) a été supprimé de tous les génomes téléchargés, laissant 1068 génomes disponibles pour une analyse plus approfondie. Les gènes de la voie de biosynthèse de la biotine inclus dans "l'orthologie KEGG (KO) - métabolisme de la biotine" ont été téléchargés dans IMG/MER et comprenaient le "ID de fonction KEGG" et le "numéro EC" pour chaque enzyme. Pour vérifier si les enzymes identifiées du métabolisme de la biotine étaient présentes dans les 1068 génomes, l'outil "Profil fonctionnel : fonction vs génome" a été appliqué. Pour déterminer si la voie métabolique de la biotine était présente, nous nous sommes particulièrement intéressés aux gènes « bioF », « bioA », « bioD » et « bioB » (voir Fig. 1). Notre critère d'attribution des bactéries comme "prototrophe biotine" était la présence des quatre gènes. Si « bioB » était présent mais qu'un ou plusieurs des trois autres gènes étaient absents, la bactérie était considérée comme capable de récupérer la desthiobiotine « auxotrophe desthiobiotine ». Si bioB était absent ainsi que d'autres gènes, les bactéries étaient classées comme "auxotrophes à la biotine". Des informations détaillées sur l'attribution des génomes bactériens individuels peuvent être trouvées dans l'ensemble de données supplémentaires 2. Les gènes associés aux taxons susmentionnés des métagénomes du microbiome de l'océan Atlantique [41] ont été utilisés pour estimer l'abondance globale des différents phénotypes de biosynthèse de la biotine. En bref, les données de séquence Illumina (numéro d'accès European Nucleotide Archive : PRJEB34453) ont été assemblées à l'aide de metaSPAdes v3.11.1 [42] et les gènes de contigs de plus de 210 bases ont été prédits à l'aide de Prodigal [43]. Les gènes résultants ont été regroupés à 95 % d'identité de séquence à l'aide de USEARCH v10.0.24 (-cluster_fast) [44] pour obtenir un ensemble de gènes non redondants. Ces séquences de gènes non redondantes ont été classées taxonomiquement à l'aide de Kaiju v1.6 [45] avec la base de données Refseq nr (mai 2018) et ProGenomes [46] comprenant des séquences procaryotes, eucaryotes et virales. D'autres détails méthodologiques peuvent être trouvés ailleurs [41].

Pour comprendre si la présence de bioB seul, mais l'absence de tous les gènes précédents de la voie de biosynthèse de la biotine, permet aux procaryotes de surmonter leur auxotrophie de la biotine, nous avons criblé différentes Alphaprotéobactéries pour leur potentiel génétique dans la voie de la biotine. Nous avons sélectionné trois souches dans lesquelles les quatre derniers gènes de la voie de la biotine étaient absents (bioF, bioA, bioD, bioB ; Fig. 2A) et trois souches dans lesquelles seul le gène codant pour la biotine synthase (bioB) était présent (Fig. 2B).

A, B représentant la présence du gène de la voie de la biotine des isolats bactériens des expériences de croissance respectives ci-dessous (A les quatre derniers gènes de la biotine sont manquants ; B seul bioB est présent). C–H Expériences de croissance avec les ajouts respectifs de biotine (orange, triangle), de desthiobiotine (jaune, carré) ou sans ajout (gris, cercle) pour 6 isolats bactériens du groupe Roseobacter avec différents potentiels de voie de biosynthèse de la biotine (C, E & auxotrophe de la biotine G ; auxotrophe de la desthiobiotine D, F et H).

Deux des bactéries testées dépourvues des quatre gènes de la voie de la biotine, P. marinus (Fig. 2C) et Sulfitobacter sp. DFL-14 (Fig. 2G) n'a pas poussé et S. qiaohouensis a montré un rendement de croissance significativement inférieur lorsque la desthiobiotine a été ajoutée par rapport à l'ajout de biotine (Fig. 2E). Celeribacter indicus (Fig. 2D), R. mucosus (Fig. 2F) et Sulfitobacter sp. EE-36 (Fig. 2H), qui possèdent tous bioB, permettant la dernière réaction enzymatique pour convertir la desthiobiotine en biotine, présentaient différentes caractéristiques de croissance : C. indicus s'est développé avec l'ajout de biotine ou de desthiobiotine, mais n'a pas poussé lorsque ni l'un ni l'autre n'a été complété. Le taux de croissance et le rendement de C. indicus n'étaient pas significativement différents lorsque la biotine ou la desthiobiotine était ajoutée à une concentration de 1 nM. Des résultats similaires ont été observés pour R. mucosus où une croissance significativement accrue a été observée avec l'ajout de biotine ou de desthiobiotine, sans différence significative de taux de croissance ou de rendement entre les deux ajouts (tableau supplémentaire S2), mais nous avons également observé une faible croissance sans le l'ajout de l'un ou l'autre composé. Sulfitobacter sp. EE-36, d'autre part, n'a augmenté qu'avec l'ajout de biotine, mais lorsque la desthiobiotine a été complétée, aucune croissance n'a été observée. Les mesures étant basées sur la densité optique, on ne peut exclure la possibilité que chez R. mucosus ce ne soit pas le nombre de cellules mais la taille des cellules qui soit responsable de la différence observée, néanmoins l'ajout de desthiobiotine semble avoir une influence.

Nous avons cultivé P. minimum avec et sans biotine pour déterminer si ce dinoflagellé marin est auxotrophe pour la biotine. Seul l'ajout de biotine a permis à P. minimum de se développer, comme le montre la fluorescence relative (Fig. S6 supplémentaire). Pour tester si P. minimum est capable de surmonter son auxotrophie à la biotine par l'ajout de desthiobiotine, nous avons complété P. minimum avec 1 nM de desthiobiotine, mais nous n'avons pas observé de croissance.

Sachant que seul l'ajout de biotine conduit à la croissance de P. minimum, nous avons réalisé une expérience de co-culture, cultivant P. minimum avec C. indicus, qui peut surmonter son auxotrophie en biotine par l'ajout de desthiobiotine (voir ci-dessus, Fig. 2D).

La croissance de P. minimum, contrôlée par fluorescence relative, n'a été observée qu'avec l'ajout de biotine. La supplémentation en desthiobiotine de la co-culture n'a pas entraîné la croissance de P. minimum. Pour s'assurer qu'il ne s'agit pas de l'incapacité de C. indicus à utiliser les sources de carbone organique libérées par P. minimum, nous avons également ajouté du substrat à la co-culture en même temps que l'ajout de desthiobiotine. Le nombre de cellules bactériennes mesuré au début de la phase de croissance stationnaire prouve que, malgré une croissance bactérienne accrue, il n'y a pas de libération de biotine, nécessaire à la croissance de P. minimum (Fig. S6 supplémentaire).

Les sources naturelles de biotine et sa disponibilité dans plusieurs écosystèmes marins ont déjà été déterminées [27,28,29,30], mais qui et comment la desthiobiotine est libérée et sa concentration dans de vastes zones océaniques sont jusqu'à présent largement inexplorées [26, 27]. À l'aide de la spectrométrie de masse, nous avons mesuré la biotine et la desthiobiotine de manière intra- et extracellulaire dans une culture de V. campbellii (prototrophe de la biotine) à trois moments au cours des phases de croissance et dans quatre échantillons d'eau de mer prélevés en mer du Nord (Fig. 3 et Fig. S1). La biotine et la desthiobiotine ont été analysées de manière intracellulaire avec une récupération de 99 % chacune et de manière extracellulaire avec une récupération de 30 et 29 % et une limite de détection (LOD) de 0,15 pM et 0,03 pM, respectivement (tableau supplémentaire S3). Dans les échantillons intracellulaires et extracellulaires, le nombre de molécules de biotine détectées par cellule était relativement faible entre 42 ± 3,7 et 1267 ± 280,1 molécules par cellule. Le nombre de desthiobiotine extracellulaire détectée était beaucoup plus élevé, atteignant 1,09 ± 0,15*106 molécules par cellule dans la phase de croissance stationnaire de V. campbellii. Entre les concentrations intra- et extracellulaires de desthiobiotine, nous avons observé une variation notable. Le nombre intracellulaire de molécules de desthiobiotine par cellule a atteint 4,4 ± 0,91*104 dans la phase mi-exponentielle, 8,1 ± 0,87*105 dans la phase exponentielle tardive et 7,2 ± 0,27*105 dans la phase stationnaire précoce. En revanche, les molécules de desthiobiotine extracellulaire par cellule ont diminué de manière continue du milieu de la phase exponentielle tardive à la phase stationnaire précoce, produisant 9, 3 ± 0, 15 * 106, 1, 6 ± 0, 38 * 104 et 2, 2 ± 0, 62 * 103 molécules par cellule.

Croissance de V. campbellii sur glutamate sans ajout de vitamines B, surveillée par le nombre de cellules au cytomètre en flux au fil du temps. Les barres affichent les concentrations extracellulaires (barre blanche) et intracellulaires (barre rayée) de biotine (orange) et de desthiobiotine (jaune) pendant la phase de croissance exponentielle, exponentielle tardive et stationnaire tardive de V. campbellii.

Alors que la biotine a été détectée dans les quatre échantillons d'eau de mer de la mer du Nord examinés, la desthiobiotine n'a été détectée que dans l'un d'entre eux, avec une concentration de 2,8 ± 0,1 pM. Indépendamment des lieux d'échantillonnage (estuaire, près du rivage, haute mer), les concentrations de biotine étaient toutes à des valeurs comparatives, comprises entre 12,2 ± 0,1 et 19,8 ± 0,6 pM (Fig. S1 supplémentaire).

Pour évaluer quelles bactéries manquent ou possèdent le potentiel génétique pour synthétiser la biotine, ou sont susceptibles de surmonter une éventuelle auxotrophie par l'apport de desthiobiotine, nous avons examiné la présence de gènes (bioF, bioA, bioD, bioB) codant pour les quatre dernières réactions enzymatiques en cascade. de la voie de la biotine (Fig. 1). En considérant les 1068 génomes bactériens recensés, la part des bactéries incapables de synthétiser la biotine est de 51,8 % et celle des prototrophes de 48,2 % (Fig. 4B). De toutes les bactéries examinées, 20,3% possèdent au moins bioB mais manquent d'au moins un autre gène de la voie de la biotine et nécessitent donc des sources exogènes de biotine ou de desthiobiotine. Dans ce groupe bactérien, 62,2 % ne codent que pour le tout dernier gène (bioB) de la voie de la biotine.

A Représenté sont la présence de gènes pour la subdivision en phénotypes biosynthétiques de la biotine (auxotrophe biotine = gris, auxotrophe desthiobiotine = jaune et prototrophe biotine = orange) comme présenté dans B–E. B – E Les gènes biosynthétiques de la biotine de 1068 génomes de bactéries aquatiques ont été analysés et classés en phénotypes biosynthétiques de la biotine. L'abondance relative de toutes les bactéries B analysées, des phylums et des classes C, des ordres D des Alphaprotéobactéries et des ordres E des Gammaprotéobactéries est indiquée.

De grandes différences existent entre les différents groupes phylogénétiques dans la capacité à synthétiser la biotine (Fig. 4C). Par exemple, une grande partie des bêtaprotéobactéries (76,6 %), des gammaprotéobactéries (91,1 %) et des flavobactéries (69,3 %) possèdent les quatre gènes et peuvent donc probablement synthétiser la biotine de novo. La fraction des génomes bactériens qui, sous contraintes génétiques, sont auxotrophes pour la biotine mais peuvent utiliser la desthiobiotine est particulièrement élevée chez Clostridia (82,9%), Cyanophyceae (57,1%) et Bacilli (29,4%). Le pourcentage le plus élevé de vrais auxotrophes de la biotine a été trouvé dans les alphaprotéobactéries (57,3 %), les déinocoques (93,8 %) et les actinobactéries (46,8 %). De plus, nous avons examiné les Alpha- et Gammaprotéobactéries au niveau taxonomique de l'ordre. En particulier, les ordres d'alphaprotéobactéries présentent des différences significatives dans leur potentiel de biosynthèse de la biotine (Fig. 4D). Le clade SAR11 et la majorité des Hyphomicrobiales, Rhodobacterales et Rhodospirillales ne codent pas les gènes codant pour la biosynthèse de la biotine ou permettant le salut par la desthiobiotine. En revanche, la grande majorité des Caulobacterales possède la capacité de récupérer la desthiobiotine et la plupart des Sphingomonadales étudiés possèdent tous les gènes pour la synthèse de la biotine. Les variations potentielles de la voie de la biotine au sein des gammaprotéobactéries étaient faibles, les prototrophes de la biotine dominaient tous les ordres (Fig. 4E).

Pour comprendre les implications écosystémiques de nos découvertes génomiques sur le potentiel de la voie de la biotine pour les communautés procaryotes, nous avons lié notre analyse génomique à un catalogue de référence de métagénome. Par conséquent, nous avons effectué une analyse similaire dans les métagénomes proches de la surface d'un transect latitudinal à travers l'océan Atlantique de 62 ° S à 47 ° N couvrant toutes les provinces biogéographiques [41]. Le pourcentage de la communauté procaryote (part de toutes les lectures de tous les gènes) pour laquelle nous avons pu rendre compte du potentiel de la voie de la biotine variait entre 2,8 % et 11,9 %. La grande abondance de représentants séquencés du génome individuel, tels que les cyanobactéries dans les provinces (sous)équatoriales, peut augmenter de manière significative la proportion de génomes connus au sein d'une communauté analysée. Les communautés procaryotes analysées et représentées proviennent d'un seul point d'échantillonnage et ne reflètent pas les changements temporels ou saisonniers au sein d'une communauté dans une province océanique donnée.

La fraction de bactéries prototrophes à biotine est de loin la plus importante dans la plupart des régions du transect et particulièrement élevée dans les régions tropicales et subtropicales (Fig. 5B). Cependant, dans la région tempérée et subantarctique du sud, la part des auxotrophes de la biotine constitue au moins la moitié de la communauté totale. La part des procaryotes capables d'utiliser la desthiobiotine pour synthétiser la biotine et surmonter une auxotrophie potentielle dans ces régions varie entre 8,5 et 13,1% du total, soit 14,8 à 26,1% de la communauté auxotrophe. Dans l'Atlantique tempéré nord, la fraction des prototrophes de la biotine comprend encore au moins les deux tiers, et le tiers restant est principalement réparti également entre les procaryotes incapables de synthétiser la biotine de novo et ceux qui peuvent surmonter leur auxotrophie potentielle en utilisant la desthiobiotine (Fig. 5B ).

A Représenté sont la présence de gènes pour la subdivision en phénotypes biosynthétiques de la biotine (auxotrophe biotine = gris, auxotrophe desthiobiotine = jaune et prototrophe biotine = orange) comme présenté en B. Carte illustrant 22 stations (points noirs) de 62 ° S dans l'océan Austral à 47 °N dans l'Atlantique Nord, échantillonné à 20 m de profondeur lors d'une campagne avec le RV Polarstern. L'abondance relative des bactéries marines codant pour les quatre derniers gènes de la biosynthèse enzymatique de la biotine (prototrophe de la biotine ; orange), des bactéries dépourvues de la voie complète de la biotine mais codant au moins bioB (auxotrophe de la desthiobiotine ; jaune) et des bactéries dépourvues des gènes de la voie de biosynthèse de la biotine (auxotrophe de la biotine, gris) apparaît dans les camemberts des stations d'échantillonnage individuelles. Le pourcentage indiqué dans chaque camembert représente la proportion de procaryotes séquencés du génome dans lesquels le potentiel de biosynthèse de la biotine de l'ensemble de la communauté procaryote (identifié par le gène ARNr 16S) a été détecté. Les concentrations annuelles en surface de chlorophylle a (mg m−3) sont indiquées dans un spectre de couleur verte.

Dès 1901, la biotine a été identifiée comme un facteur favorisant la croissance [47], suivie de son isolement et de sa purification en 1941 [48] et de nombreuses découvertes importantes ont été faites par la suite. Plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes ont été identifiés comme auxotrophes de la biotine et un effet favorisant la croissance des vitamères de biotine a été observé [21, 22, 23, 24, 49]. Depuis lors, la biotine a été largement négligée par rapport à d'autres vitamines B bien connues et largement étudiées, la thiamine et la cobalamine, dans les écosystèmes marins [12,13,14,15,16,17].

Malgré des avancées majeures dans le séquençage du génome ces dernières années, l'importance et la distribution de l'auxo- et de la prototrophie de la biotine dans les écosystèmes marins restent largement inexplorées. Grâce à l'étude de Sañudo-Wilhelmy et al. (2014) [10], il y avait des premières indications que de nombreuses bactéries marines ne peuvent pas synthétiser la biotine de novo. Cependant, pour la détermination des synthétiseurs de biotine, les auteurs n'ont tenu compte que de l'existence de bioB, qui catalyse la dernière réaction enzymatique dans la voie de cascade de la biotine. Dans notre étude, nous montrons que de toutes les bactéries dont on prédit génomiquement qu'elles sont incapables de synthétiser la biotine de novo, 39,2 % codent encore pour le gène bioB. À la lumière de nos résultats, nous supposons qu'il est probable que l'enquête de Sañudo-Wilhelmy et al. (2014) ont identifié à tort certaines bactéries comme prototrophes de la biotine. Les résultats présentés ici reflètent de larges variations dans le potentiel de biosynthèse de la biotine entre les groupes taxonomiques jusqu'au niveau de la classe. Par exemple, la majorité des Alphaprotéobactéries ne présentent pas une voie complète de la biotine. Des études sur l'alimentation croisée de biotine dans des co-cultures et des consortiums définis, où la biotine est libérée par des algues eucaryotes et généralement absorbée par des bactéries auxotrophes de biotine alphaprotéobactériennes, étayent nos données [18,19,20]. L'expression transcriptomique des gènes de synthèse de la biotine dans les écosystèmes marins à partir d'ordres importants d'alphaprotéobactéries, tels que SAR11, SAR116 et Rhodobacterales, reflète également la dépendance de cette sous-classe à la biotine [50] et expérimentalement, il a été démontré que le membre abondant du clade SAR11, Candidatus Pelagibacter ubique, est un auxotrophe de la biotine [51]. De plus, notre évaluation montre que la grande majorité des gammaprotéobactéries et des flavobactéries possèdent les exigences génétiques pour la synthèse de la biotine. Encore une fois, l'expression du gène de la biotine confirme que ces deux classes taxonomiques sont des producteurs primaires de biotine dans la nature [50].

En général, notre évaluation suggère qu'environ la moitié de toutes les bactéries aquatiques peuvent synthétiser la biotine de novo (Fig. 4B). Pour mieux comprendre le potentiel réel de synthèse de la biotine dans les écosystèmes marins, l'abondance des représentants individuels doit être prise en compte. Bien que notre analyse ne couvre qu'entre 2,8 % et 11,9 % de la communauté procaryote donnée, nous pouvons reconnaître que dans les provinces océaniques subtropicales et tropicales, la majorité des bactéries considérées pour cette étude peuvent synthétiser de la biotine de novo, alors que dans les zones tempérées et subpolaires du sud, la la part des bactéries soi-disant auxotrophes à la biotine étudiées peut dépasser 50 %. Cette découverte suggère que les communautés procaryotes peuvent différer considérablement dans leur potentiel de biosynthèse de la biotine, et pour une compréhension holistique de la biogéochimie et du cycle de la biotine, nous devons accorder plus d'attention à la composition des communautés microbiennes à l'avenir. La question de savoir si une carence en biotine peut affecter la vie planctonique dans l'océan, comme cela a été montré pour la cobalamine [17, 52], par exemple, est incertaine à l'heure actuelle. Cependant, nous savons également pour la biotine que la croissance bactérienne peut être limitée par la disponibilité limitée du cofacteur, même à de faibles valeurs de pM dans les cultures discontinues [31, 51]. Les mesures relativement peu nombreuses de biotine dissoute dans l'eau de mer ont révélé de fortes variations, allant d'un seuil de détection inférieur (<1,2 pM) à 700 pM [27,28,29,30,31]. De manière notable, en particulier dans les régions tempérées à fortes fluctuations saisonnières, les concentrations de biotine dans les eaux de surface se situent dans la plage picomolaire basse ou en dessous de la limite de détection [30]. Nous avons observé une tendance similaire dans nos échantillons d'eau de la mer du Nord, où les concentrations n'atteignaient que 19,8 ± 0,6 pM ou même moins. Fait intéressant, nos analyses génomiques indiquent que, en particulier dans les régions où les concentrations de biotine les plus faibles ont été mesurées dans le passé, la proportion de bactéries potentiellement auxotrophes pour la biotine est particulièrement élevée, jusqu'à plus de la moitié de la communauté bactérienne étudiée. Même si de faibles concentrations de biotine dissoute ne représentent pas les taux de production et de consommation mais suggèrent un renouvellement microbien rapide, il semble particulièrement prometteur d'étudier les hautes latitudes des hémisphères nord et sud comme critiques pour les effets de la disponibilité de la biotine sur les communautés procaryotes marines.

On estime que la moitié de toutes les bactéries séquencées du génome aquatique analysées sont incapables de synthétiser la biotine de novo et peuvent donc souffrir d' auxotrophie de la biotine et dépendent de l'apport d'autres micro-organismes dans ces écosystèmes. Un résultat clé présenté ici est qu'une grande partie des bactéries auxotrophes potentielles pour la biotine code pour le gène de la biotine synthase (bioB) qui catalyse l'étape finale de la voie de la biotine, et peut donc probablement surmonter leur auxotrophie lorsque le précurseur de la biotine, la desthiobiotine, est disponible. En fait, nous avons démontré expérimentalement que deux bactéries ne possédant que la biotine synthase peuvent surmonter leurs besoins en biotine grâce à l'apport de faibles concentrations de desthiobiotine et atteindre le même taux de croissance qu'avec l'apport de biotine. Que la desthiobiotine pénètre également dans les cellules au moyen des transporteurs de biotine BioMNF, un transporteur de force de couplage d'énergie, ou par YigM reste actuellement inconnue [53]. Dès les années 1940, il a été observé que certaines bactéries auxotrophes à la biotine pouvaient se développer avec l'ajout de desthiobiotine [22, 23]. Deux décennies plus tard, il a été démontré pour la première fois que des bactéries marines individuelles peuvent également surmonter leur auxotrophie de la biotine en présence de desthiobiotine [21]. Contrairement aux expériences menées à cette époque, nous avons utilisé des concentrations que l'on peut également trouver dans le milieu marin naturel [28] indiquant que les concentrations naturelles de desthiobiotine sont suffisantes pour surmonter l'auxotrophie de la biotine des bactéries. Outre les bactéries, les champignons peuvent également utiliser la desthiobiotine pour surmonter leur auxotrophie à la biotine [23, 24, 49]. Que d'autres eucaryotes au-delà des champignons possèdent cette capacité est encore inconnue, à notre connaissance. La recherche poursuivant l'importance écologique de ces découvertes était difficile avec l'état des connaissances à ce moment-là et s'est effilée. Sur la base de l'évaluation génomique du potentiel de la voie de la biotine, nous avons identifié une capacité probable généralisée de diverses bactéries marines à surmonter leurs besoins potentiels en biotine grâce à la desthiobiotine. Trente-neuf pour cent de toutes les bactéries incapables de synthétiser la biotine de novo codent pour une biotine synthase et possèdent ainsi la base génétique pour convertir la desthiobiotine en biotine. Cependant, toutes les bactéries codant pour le gène bioB ne peuvent pas surmonter leurs besoins en biotine dans des conditions expérimentales de laboratoire lorsque la desthiobiotine est fournie. Cet écart entre les traits phénotypiques attendus du génotype et notre observation expérimentale doit être pris en compte lors de l'interprétation du potentiel de la voie métabolique de la biotine bactérienne. Une explication possible de la croissance observée de R. mucosus et S. qiaohouensis indépendamment de tout ajout de biotine ou de desthiobiotine pourrait être qu'il existe une voie alternative, encore inconnue, de synthèse de la biotine ou que certaines bactéries ont trouvé un moyen de contourner une dépendance obligatoire à la biotine. . Ce dernier scénario est déjà connu pour d'autres vitamines, telles que la cobalamine [54], mais à notre connaissance n'a pas été envisagé pour la biotine jusqu'à présent. Cependant, la part des auxotrophes présumés de la biotine qui codent pour bioB dans tous les auxotrophes de la biotine d'une communauté procaryote marine peut représenter plus d'un cinquième de la communauté bactérienne analysée (Fig. 5B). Cette grande proportion inattendue de bactéries qui, avec une grande probabilité, sont capables de convertir la desthiobiotine en biotine remet en question notre perspective actuelle sur l'importance de la disponibilité de la biotine et le rôle de la desthiobiotine dans le cycle de la biotine dans l'océan.

Le fait que de nombreuses bactéries aquatiques codent pour le gène bioB mais ont perdu les prérequis génétiques pour l'ensemble de la voie de la biotine peut être bien placé dans les concepts communs d'écologie microbienne. En principe, l'observation de la perte de gènes dans les voies métaboliques individuelles, comme déjà observée pour d'autres vitamines B [14, 38], ne semble pas rare et peut être expliquée par la théorie de la rationalisation du génome [55]. Néanmoins, il est remarquable de voir combien de bactéries ont perdu la voie de biosynthèse de la biotine tout en conservant bioB, ce qui suggère que l'approvisionnement en desthiobiotine est bien maintenu. Nous pouvons penser à deux explications pour lesquelles la synthèse de novo de la biotine est perdue mais le dernier gène de la voie de synthèse de la biotine reste présent ; (i) une activité enzymatique de BioB dans une réaction métabolique jusqu'alors inconnue ; (ii) un avantage évolutif pour pouvoir convertir la desthiobiotine en biotine comme proposé par l'hypothèse de la Reine Noire (BQH) [56, 57]. Bien que de nombreuses enzymes et réactions enzymatiques aient été identifiées, il est très probable que nombre d'entre elles soient inconnues. Par exemple, Candidatus Pelagibacter ubique, un membre très abondant du clade SAR11, ne code que le gène bioA. Il a été proposé que ce gène résiduel de la voie de la biotine pourrait jouer un rôle essentiel dans la synthèse du pantothénate [51]. En supposant que l'enzyme codée BioB est impliquée dans une réaction métabolique jusqu'ici inconnue mais indispensable en plus de la synthèse de biotine, cela pourrait fournir une explication quant à la raison pour laquelle tant de bactéries possèdent une voie simplifiée de la biotine, mais conservent toujours bioB. La deuxième explication décrit un scénario dans lequel les bactéries bénéficient de la perte de traits génétiques pour la synthèse de certains facteurs de croissance, tels que des vitamines ou des parties de leurs voies de biosynthèse, dans la mesure où un apport exogène de ces composés est constamment disponible. La perte de la voie de la biotine, à l'exception de bioB, conduit à un coût métabolique inférieur, car la biotine ne peut pas être synthétisée de novo, et à un génome rationalisé. L'inconvénient est que la perte rend les bactéries auxotrophes dépendantes de la disponibilité du micronutriment essentiel biotine. Le maintien de bioB réduit la dépendance à la biotine dans la nature et permet l'utilisation de la desthiobiotine comme deuxième source pour surmonter une auxotrophie de la biotine. Un autre avantage des bactéries auxotrophes desthiobiotine à génome rationalisé qu'il ne faut pas négliger, notamment pour celles vivant dans les provinces océaniques oligotrophes, est qu'elles économisent deux atomes d'azote, car ceux-ci sont incorporés en amont de la synthèse de la biotine. Sur des échelles de temps évolutives, cela aurait pu amplifier la perte des gènes précédents de la voie de la biotine.

La conservation d'un seul gène d'une voie, comme dans le cas de bioB, ne peut être significative que si le vitamère requis respectif, la desthiobiotine, est disponible en tant que bien public dans les écosystèmes marins. Nous détectons la desthiobiotine dans l'un des quatre échantillons d'eau de mer que nous avons prélevés en mer du Nord à une concentration de 2,8 ± 0,1 pM. Dans l'océan Atlantique, la desthiobiotine a été détectée à 27 pM, légèrement plus élevée que la biotine [27] et dans des échantillons prélevés dans un évent hydrothermal et un fond marin dans l'océan Pacifique, les concentrations de desthiobiotine étaient significativement plus élevées que celles de la biotine, atteignant jusqu'à 100 après-midi [26].

Bien que nous sachions que la desthiobiotine est présente dans l'environnement et que sa masse moléculaire a été détectée par MS à résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier dans l'exométabolome d'une bactérie marine, ses sources naturelles sont restées largement inconnues [58]. Les résultats expérimentaux présentés ici montrent qu'une bactérie prototrophe biotine peut être une source de desthiobiotine. Malgré le fait que V. campbellii puisse synthétiser la biotine de novo (sur la base de découvertes génétiques et expérimentales), nous avons pu détecter la desthiobiotine de manière intracellulaire à une concentration beaucoup plus élevée que la biotine et à des concentrations encore plus élevées dans son exométabolome. L'écart entre les concentrations de biotine intracellulaire et extracellulaire pourrait être lié au fait que la biotine est liée de manière covalente aux enzymes, donc le cofacteur pourrait être lié de manière intracellulaire aux enzymes et donc pas entièrement capturé par notre méthode d'extraction. Le mécanisme par lequel les vitamines B, y compris la biotine, sont libérées est encore largement inconnu [59]. La structure chimique de la desthiobiotine et de la biotine diffère considérablement, la biotine ayant un cycle tétrahydrothiophène contenant du soufre fusionné à un groupe uréido. La question de savoir si la structure chimique affecte l'exportation ou l'importation de biotine ou de son précurseur, la desthiobiotine, reste incertaine à l'heure actuelle. Indépendamment des mécanismes actifs possibles d'exportation de biotine, une fuite accrue de la desthiobiotine par rapport à la biotine pourrait expliquer ses valeurs extracellulaires plus élevées pour V. campbellii et ainsi fournir la base de son absorption et de sa récupération généralisées.

Ensemble, ces résultats suggèrent que la desthiobiotine peut être produite et libérée par des bactéries et que sa disponibilité dans l'océan peut contribuer de manière significative à satisfaire les micro-organismes auxotrophes de la biotine qui retiennent la biotine synthase. Pourtant, en plus de la biosynthèse bactérienne et de la libération de desthiobiotine, un autre mécanisme jusqu'ici largement inconnu pourrait contribuer de manière significative à la source naturelle de desthiobiotine. Pour les diatomées, par exemple, il a été montré que l'étape enzymatique finale (BioB) pour convertir la desthiobiotine en biotine nécessite du fer. Lorsque le fer est épuisé, l'expression de la biotine synthase bioB est fortement réduite [60]. La question de savoir si l'expression réduite des gènes lors de la déplétion en fer affecte uniquement la biotine synthase ou une réaction enzymatique antérieure (BioF, BioA ou BioD) n'a pas encore été identifiée. L'inhibition de la biotine synthase sans boucle de rétroaction de la voie en cascade de la biotine pourrait potentiellement conduire à un excès de desthiobiotine et à sa libération ultérieure. En particulier, les régions tempérées et subantarctiques du sud de l'Atlantique sont des zones typiques où les diatomées dominent la communauté phytoplanctonique et où la limitation en fer est courante [52, 61]. Si tel est le cas, les bactéries vivant à proximité spatiale des diatomées pourraient éventuellement convertir la desthiobiotine en biotine et ainsi combler les conséquences négatives de la carence en fer sur la synthèse de la biotine chez les diatomées.

Les nouvelles données présentées ici suggèrent que l'alimentation croisée de la desthiobiotine microbienne contribue de manière significative à la disponibilité de la biotine dans l'océan. La part des bactéries qui possèdent la base génétique pour convertir la desthiobiotine en biotine n'est pas également représentée dans tous les groupes taxonomiques. Les bactéries du groupe Roseobacter dotées de cette capacité constituent une fraction relativement importante. Des abondances élevées de ce groupe bactérien se trouvent souvent dans les efflorescences algales et sont connues pour interagir étroitement avec les organismes phytoplanctoniques [62, 63]. Afin de mieux comprendre l'impact de la desthiobiotine sur la disponibilité de la biotine marine, nous avons co-cultivé une bactérie auxotrophe biotine du groupe Roseobacter, C. indicus, qui s'est avérée capable de surmonter son auxotrophie par l'ajout de desthiobiotine, avec un auxotrophe phototrophe eucaryote de la biotine, P. minimum. La capacité de C. indicus à convertir la desthiobiotine en biotine pour surmonter sa propre auxotrophie n'a pas entraîné la libération de biotine pour soutenir P. minimum dans la co-culture obligatoire. En ajoutant du substrat à la co-culture en plus de la desthiobiotine, nous avons pu montrer que la croissance bactérienne n'était pas inhibée par P. minimum. L'augmentation du nombre de cellules bactériennes dans la phase stationnaire et la croissance lors de l'ajout de biotine des deux en co-culture ont également exclu une inhibition de croissance réciproque de l'un ou l'autre. Comme le montrent nos données, certaines bactéries ne partagent pas nécessairement la desthiobiotine convertie en biotine avec leur environnement, même si les bactéries hétérotrophes sont dépendantes de l'apport de composés carbonés organiques, comme dans notre dispositif expérimental. Même si, comme dans cette expérience, il n'y a pas d'apport direct de biotine, on peut supposer que dans un environnement naturel, la biotine intracellulaire est rendue disponible par une alimentation bâclée ou une infection virale.

Nous avons montré que les bactéries auxotrophes à la biotine qui codent encore pour la biotine synthase (BioB) peuvent se développer avec l'apport de faibles concentrations du précurseur de la biotine, la desthiobiotine. La capacité à surmonter l'auxotrophie de la biotine par l'absorption de la desthiobiotine semble être très élevée chez les bactéries aquatiques et représente également une proportion importante dans les provinces océaniques mésotrophes telles que l'Atlantique sud tempéré et subantarctique. Même s'il était déjà connu que la desthiobiotine est présente dans les environnements marins, nous avons pu montrer que la desthiobiotine est également excrétée à des concentrations élevées par les bactéries prototrophes de la biotine. Nos résultats suggèrent que la desthiobiotine joue un rôle important pour une grande partie des communautés bactériennes auxotrophes dans l'océan et que le précurseur de la biotine a une importance jusque-là inconnue dans le cycle de la biotine marine. Les interactions microbiennes complexes biotine-vitamère qui vont au-delà du simple échange de biotine sont un scénario envisageable dans les océans et devraient être étudiées plus en profondeur.

Les ensembles de données générés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le capitaine du RV Senckenberg et son équipage pour leur soutien. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft au sein du Transregional Collaborative Research Center Roseobacter (TRR51).

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Institut de chimie et de biologie de l'environnement marin, Université d'Oldenbourg, Carl von Ossietzky Str. 9-11, D-26129, Oldenbourg, Allemagne

Gerrit Wienhausen, Stefan Bruns, Sabiha Sultana, Leon Dlugosch, Luna-Agrippine Groon, Heinz Wilkes & Meinhard Simon

Institut Helmholtz pour la biodiversité marine fonctionnelle à l'Université d'Oldenburg (HIFMB), Ammerländer Heerstraße 231, D-26129, Oldenburg, Allemagne

Simon Meinhard

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GW a conçu et réalisé la plupart des expériences, effectué la plupart des analyses de données et rédigé le manuscrit ; SS a réalisé l'expérience de co-culture et a participé aux expériences de culture bactérienne, LAG a participé aux expériences de culture bactérienne et aux mesures de comptage cellulaire, LD a réalisé l'évaluation bioinformatique de base des analyses métagénomiques ; SB & HW ont collecté des échantillons d'eau de mer et effectué les analyses LC-MS de biotine et de desthiobiotine, MS a contribué à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont soigneusement révisé le manuscrit.

Correspondance à Gerrit Wienhausen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wienhausen, G., Bruns, S., Sultana, S. et al. Le rôle négligé d'un précurseur de la biotine pour les bactéries marines - la desthiobiotine comme voie d'évacuation pour l'auxotrophie de la biotine. ISME J 16, 2599-2609 (2022). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01304-w

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Reçu : 28 avril 2022

Révisé : 19 juillet 2022

Accepté : 28 juillet 2022

Publié: 13 août 2022

Date d'émission : novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-022-01304-w

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