Analyse détaillée de la rétine déformée et de son interaction avec les résidus environnants dans l'intermédiaire K de la bactériorhodopsine
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Analyse détaillée de la rétine déformée et de son interaction avec les résidus environnants dans l'intermédiaire K de la bactériorhodopsine

Mar 27, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 190 (2023) Citer cet article

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L'intermédiaire K de la bactériorhodopsine de pompage de protons est le premier intermédiaire généré après l'isomérisation du rétinal en la forme 13-cis. Bien que diverses structures aient été rapportées pour l'intermédiaire K jusqu'à présent, celles-ci diffèrent les unes des autres, notamment en termes de conformation du chromophore rétinien et de son interaction avec les résidus environnants. Nous rapportons ici une analyse cristallographique aux rayons X précise de la structure K. On observe que la chaîne polyène du rétinal 13-cis est en forme de S. La chaîne latérale de Lys216, qui est liée de manière covalente à la rétine via la liaison base de Schiff, interagit avec les résidus, Asp85 et Thr89. De plus, le Nζ-H de la liaison base de Schiff protonée interagit avec un résidu, Asp212 et une molécule d'eau, W402. Sur la base de calculs de chimie quantique pour cette structure K, nous examinons les facteurs de stabilisation de la conformation déformée du rétinien et proposons une manière de relaxation à l'intermédiaire L suivant.

La bactériorhodopsine (bR) est une pompe à protons pilotée par la lumière présente dans la membrane plasmique d'un archéon, Halobacterium salinarum1,2, et est actuellement l'une des protéines membranaires les plus étudiées3,4. Des rhodopsines microbiennes similaires agissant comme pompes, canaux et capteurs ioniques ont été découvertes non seulement dans les archées, mais aussi dans les bactéries, les champignons et même les virus5,6,7. Toutes ces protéines, comme bR8, ont sept hélices transmembranaires et un chromophore rétinien central. Le rétinal a un squelette polyène avec de longues doubles liaisons conjuguées. Dans le cas de bR, le chromophore rétinien forme une liaison base de Schiff (SB) avec un résidu lysine en position 216 (Lys216). La rétine prend une conformation tout-trans dans l'état de repos adapté à la lumière. L'absorption de la lumière provoque l'isomérisation d'une double liaison en C13-C14 du rétinal d'une conformation trans à cis. Les changements structurels sont propagés à la partie protéique et les fonctions respectives sont exprimées.

Dans le cas de bR, un cycle de réaction se produit dans lequel une série d'intermédiaires (I, J, K, L, M, N, O) sont séquentiellement générés. Dans le cycle de réaction de bR, un seul proton est transporté de l'intérieur vers l'extérieur de la membrane plasmique. L'intermédiaire K, caractérisé par un pic d'absorption à 590 nm à température ambiante9, est le premier intermédiaire généré après isomérisation du rétinal en forme 13-cis. L'intermédiaire K peut être piégé par l'irradiation lumineuse sous des températures cryogéniques10. Il a été démontré que l'intermédiaire K produit à des températures cryogéniques avait presque les mêmes caractéristiques dans les bandes vibrationnelles que ceux produits de manière transitoire à température ambiante11,12. La structure de l'intermédiaire K a d'abord été étudiée au moyen de la technique de cryo-piégeage en combinaison avec la cristallographie aux rayons X13,14,15,16 (tableau supplémentaire 1). La structure a également été étudiée au moyen d'études cristallographiques femtosecondes en série résolues en temps (TR-SFX)17,18,19 (tableau supplémentaire 1). Ces investigations ont révélé que les changements structurels lors de la formation de l'intermédiaire K sont faibles et encore limités au voisinage autour de la rétine. Par conséquent, l'intermédiaire K est un sujet de recherche intéressant avec le potentiel de fournir un aperçu du stockage et de la propagation de l'énergie dans les protéines. Cependant, de nombreuses incohérences peuvent être trouvées parmi les structures K rapportées précédemment dans la conformation de la rétine et les détails de son interaction avec les résidus environnants. Pour cette raison, les points cruciaux du stockage et de la propagation de l'énergie au sein des protéines restent mal connus, bien qu'une estimation de l'énergie stockée ait été faite ~50 kJ/mol20.

La capacité de manipuler les cellules par la lumière a récemment conduit à l'utilisation de rhodopsines guidées par la lumière pour l'activation délibérée de neurones et d'autres cellules par optogénétique21,22. De plus, des études approfondies ont été réalisées sur l'utilisation de bR dans les matériaux photographiques23,24. En termes de développement d'applications utilisant les rhodopsines et autres protéines photoactives, il est important d'élucider le mécanisme par lequel la photoisomérisation du chromophore se traduit en mouvements fonctionnels dans les protéines. Par conséquent, dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur bR, qui est l'une des protéines photoactives les mieux étudiées, et avons effectué une analyse structurelle à haute résolution pour déterminer avec précision la conformation de son chromophore rétinien et les interactions avec l'environnement protéique dans l'intermédiaire K.

Pour accumuler l'intermédiaire K, nous avons utilisé une procédure de cryo-piégeage15 dans laquelle un cristal bR adapté à la lumière a été irradié avec une lumière verte à 100 K (Fig. 1a). Les données de diffraction d'un cristal comprenant l'intermédiaire K à ~ 1, 3 Å ont été recueillies à 15 K avec une dose absorbée de 0, 05 MGy. Cette valeur de dose d'absorption était d'un tiers de la limite à 15 K25. Par la suite, les données de diffraction de l'état fondamental ont été recueillies à partir du même cristal après irradiation de lumière rouge. La valeur moyenne I / σ (I) pour la coque la plus élevée (1, 42–1, 33 Å) était une valeur suffisamment élevée d'environ 1, 4, lorsque la limite de résolution a été déterminée comme une coque avec CC1 / 2 d'environ 0, 5 (tableau 1). Comme dans les études précédentes, des densités significatives ont été observées uniquement autour de la rétine dans la carte de Fourier différentielle (Fig. 1b). D'autre part, des densités d'électrons différentes n'ont pas été observées dans les régions éloignées de la rétine, telles que le site d'absorption des protons, le site de libération des protons ou la surface de la protéine. Les densités positives et négatives les plus fortes ont été observées autour de la liaison SB et de l'atome C20 de la rétine (Fig. 1c). De plus, des couples de densités relativement fortes ont été observés sur les atomes C14 et C15. Des densités relativement fortes ont également été observées correspondant à des changements dans les atomes individuels des autres parties du rétinal, de la chaîne latérale de Lys216 et des résidus environnants. Par conséquent, il a été possible de déterminer sans ambiguïté la structure de l'intermédiaire K (Fig. 1 supplémentaire).

a Photoisomérisation du rétinal. Le rétinal tout-trans, qui est lié à Lys216 de bR via la liaison SB, s'isomérise en rétinal 13-cis par absorption de lumière verte. Une réaction inverse est causée par l'absorption de la lumière rouge. b Une vue complète de la carte de différence F(K + bR) − F(bR). Les densités d'électrons de différence aux niveaux +4σ et -4σ sont représentées respectivement par des mailles vertes et rouges. La structure de bR est représentée par un tube en gris, tandis que la rétine est représentée par des bâtons en gris foncé. c Une vue rapprochée autour du chromophore rétinien. La structure K est représentée par des bâtons colorés, tandis que la structure de l'état fondamental est représentée par des bâtons gris. La carte de différence F(K + bR) − F(bR) est représentée par des mailles vertes et rouges à des niveaux de contour de ±3σ. La carte d'omission pour la rétine et la chaîne latérale Lys216 calculée à partir des données extrapolées est superposée sous forme de mailles grises à un niveau de contour de +3σ.

Nous avons pu collecter des données au même niveau de résolution à partir d'un autre cristal (tableau supplémentaire 2). En utilisant les données, nous avons obtenu une carte de Fourier de différence presque identique (Fig. 2a, b supplémentaires). De plus, lorsque les données sur l'état fondamental ont été collectées pour la première fois avant les données sur l'état K, la carte de Fourier différentiel montrait presque les mêmes densités que dans les cas ci-dessus (Fig. 2c, d supplémentaires). Ce fait indique que la dépendance à la séquence de mesure n'est pas si grande pour les changements structurels entre le bR et le K, comme le suggèrent les mesures spectroscopiques26. Il montre également que les rayons X n'ont exercé aucun effet nocif à une dose totale d'environ 0,1 MGy. Les trois structures K doivent en effet être presque identiques selon la superposition (Fig. 3 supplémentaire), bien que seule la forme de la boucle EF dans le cristal II diffère des deux autres. Cela peut être dû à la différence de constante de réseau de l'axe c (tableau supplémentaire 2). En fait, l'écart quadratique moyen (rmsd) entre K dans le cristal II et K dans le cristal I est de 0,9 Å, supérieur à 0,4 Å de rmsd entre K dans le cristal III et K dans le cristal I.

En ce qui concerne l'état fondamental, les données de diffraction des rayons X des cristaux I et II ont été mesurées après l'activation au laser vert et la restauration ultérieure au laser rouge, tandis que les données du cristal III ont été mesurées avant l'activation. Néanmoins, trois structures sont également presque identiques comme dans le cas des structures K (Fig. Supplémentaire 4a-c). Cela implique que le processus d'activation n'affecte pas la structure de l'état fondamental. Cette implication est également étayée par le fait que la carte de différence de Fourier entre les données du cristal I et du cristal III ne montre aucune densité significative autour de la rétine et du canal proton (Fig. 4d-f supplémentaire).

En ajustant la structure du rétinal à la densité électronique avec une haute résolution, il a été possible de déterminer la conformation du rétinal avec une grande précision. Les écarts-types des angles dièdres de la chaîne polyène étaient d'environ 10 ° dans la structure K. La chaîne polyène se plie largement du côté de l'hélice F près de l'atome C14, et la liaison C13-C20 se penche du côté Tyr185 de l'hélice F (Fig. 2a). D'autre part, la chaîne polyène se plie contre l'hélice B près de l'atome C9. En conséquence, le rétinien 13-cis dans l'intermédiaire K est courbé en forme de S lorsqu'il est vu du côté cytoplasmique. Cette conformation rétinienne pourrait fournir une très bonne explication des densités d'électrons de différence sur la carte de Fourier de différence. Lorsque les angles de torsion ont été comparés entre bR et K, la différence la plus significative a été trouvée dans la liaison C13-C14 se produisant lors de l'isomérisation trans-cis (Fig. 2b). Cependant, la différence était d'environ 120°, et non de 180°. En raison de changements dans d'autres liaisons, l'orientation de la liaison Nζ−H dans K ne change finalement que de 24° par rapport à celle de l'état fondamental. Ce petit changement relatif était cohérent avec un résultat FTIR polarisé précédent d'environ 25°, alors que les angles absolus par rapport à la normale de la membrane ne concordaient pas27. La deuxième plus grande différence dans la chaîne polyène a été trouvée dans un angle de torsion de la liaison C15-Nς. De plus, de petits changements significatifs ont été trouvés dans la plupart des autres angles de torsion de la chaîne polyène du rétinal. La carte de Fourier différentielle a indiqué que la position du cycle β-ionone se décale légèrement vers la direction SB en raison de la courbe en forme de S du polyène (Fig. 1c). En ce qui concerne la chaîne latérale de Lys216, qui forme la liaison SB avec la rétine, les angles de torsion des liaisons Cε−Nζ et Cδ−Cε ne présentaient aucun écart significatif par rapport à l'état fondamental malgré la liaison simple, indiquant la stabilisation par interactions avec l'environnement. résidus.

un squelette polyène en forme de S de la rétine vu d'une partie supérieure de la Fig. 1b. Les cartes sont présentées de la même manière que sur la figure 1b. b Les angles de torsion le long de la chaîne polyène rétinienne dans la structure K (7XJC) sont tracés en magenta. Les écarts-types, qui ont été calculés à partir de trois structures, sont indiqués par des barres d'erreur sur les valeurs moyennes représentées par des cercles creux. Les valeurs des structures respectives sont représentées par des croix. Les valeurs peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 4. Celles de la structure de l'état fondamental dans ce travail (7XJD) et une récente structure en L16 sont tracées en gris et en noir, respectivement. Les lignes horizontales noires indiquent les angles avec les énergies minimales locales pour les torsions respectives.

Bien que les changements structurels soient limités au voisinage de la rétine, des détails atomiques du changement structurel lors de la formation de l'intermédiaire K ont pu être clairement observés dans les résidus environnants. Pour la chaîne latérale de Lys216, Cε et Cδ se déplacent vers l'hélice G en plus de Nς de SB (Fig. 3a). De faibles densités de différence ont été observées le long de la chaîne principale de résidus dans l'hélice G de Phe208 à Gly218. Par l'inclinaison de la liaison C13-C20, Tyr185 se déplace vers Leu211, induisant le mouvement de Leu211 (Fig. 2a et Fig. 3b). La chaîne latérale de Trp86 tourne autour de l'axe Cα-Cβ, remplissant la partie concave de la rétine générée par l'isomérisation trans-cis (Fig. 3b). Les chaînes latérales de Arg82 et Phe208 sont également décalées par le mouvement. Ser141 dans l'hélice E et Pro186 dans l'hélice F se déplacent vers l'anneau ionone de la rétine (Fig. 3c). De plus, plusieurs résidus appartenant à l'hélice E (Ala139-Thr142) et à l'hélice F (Leu181-Val187) se déplacent également légèrement avec eux. Les changements structurels dans les chaînes principales des hélices E, F et G peuvent être liés à des bandes peptidiques insensibles à l'échange H/D observés dans les spectres FTIR de différence28.

a Une coupe transversale de la rétine au niveau de la liaison SB. La carte de différence F(K + bR) − F(bR) est représentée par des mailles vertes et rouges à des niveaux de contour de ±3σ. Les structures K sont représentées sous forme de bâtons colorés. La structure de l'état fondamental est recouverte de bâtons gris. b Une coupe transversale de rétinien au milieu du squelette polyène. c Une coupe transversale de la rétine au niveau de l'anneau β-ionone. d La carte autour d'Asp85. e La carte autour d'Asp212. f La carte autour d'Asp115.

La distance de la liaison hydrogène entre Asp85 et Thr89 n'est que légèrement raccourcie même par le mouvement de la chaîne latérale de Thr89 vers la rétine lors de la formation de l'intermédiaire K (Fig. 3d). La distance de la liaison hydrogène entre Asp85 et W402 augmente par rapport à la structure de l'état fondamental. En revanche, la distance entre Asp212 et W402 est raccourcie à 3,08 Å, bien que la distance à l'état fondamental soit de 3,40 Å (Fig. 3e). La distance entre Lys216 et Asp212 est également raccourcie de 3,93 Å pour l'état fondamental à 3,27 Å pour K par la rotation autour de la liaison Cβ-Cγ d'Asp212 en plus de l'isomérisation du rétinal. Il convient de noter qu'une rotation similaire à Asp212 a été observée dans les intermédiaires I et J antérieurs, mais pas dans K, dans une étude TR-SFX18. Un aspartate protoné, Asp115, au voisinage de la rétine ne semble pas avoir d'implication directe dans le pompage des protons. Asp115 forme deux liaisons hydrogène avec Thr90, à la fois à l'état fondamental et à l'intermédiaire K (Fig. 3f). Cependant, le mode de liaison hydrogène change légèrement en déplaçant Asp115. Cela peut correspondre à un changement dans l'environnement d'Asp115 suggéré par un résultat FTIR précédent29.

En raison des grands changements de position de C20 par l'isomérisation de la rétine, la distance entre C20 et Cε1 de Tyr185 dans l'hélice F est réduite à 3, 45 Å contre 4, 25 Å à l'état fondamental (Fig. 4a et Supplémentaire Fig. 5a). Cependant, les distances entre C13 et les atomes de Tyr185 ne sont pas largement modifiées. En ce qui concerne le mode d'interaction entre C20 et Trp182 situés du côté cytoplasmique de la rétine, la distance à Cδ1 de Trp182 est réduite à 3,22 Å à partir de 3,76 Å, tandis que la distance entre C20 et Nε1 de Trp182 est presque inchangée. Les interactions énergétiquement défavorables avec de courtes distances ne sont pas observées dans notre structure K. Par conséquent, on peut supposer que les interactions CH∙∙∙π et π∙∙∙π observées entre la rétine et ces résidus environnants sont des interactions attractives.

a Les distances interatomiques <3,5 Å entre la rétine et les résidus environnants sont indiquées, tandis que celles de l'état fondamental sont entre parenthèses. Les lignes pointillées sont colorées en fonction des changements des distances lors de la formation de K, le rouge et le bleu indiquant respectivement un grand (> 0,2 Å) décrément et un grand incrément. b Les liaisons hydrogène avec des distances <3,5 Å du côté EC de la liaison SB sont indiquées, tandis que celles de l'état fondamental sont entre parenthèses.

Pour la liaison hydrogène du côté EC de la liaison SB, seul Nζ de Lys216 montre des changements significatifs lors de la formation de K (Fig. 4b et Fig. 5b supplémentaire). Bien que la distance entre Nζ de Lys216 et Oδ1 de Asp212 dans l'état fondamental soit de 3,93 Å, indiquant aucune interaction significative, elle diminue à 3,27 Å dans l'intermédiaire K. La distance entre Nζ de Lys216 et W402 augmente de 0,28 Å à 3,07 Å. Les niveaux σ des différences pour ces deux distances étaient supérieurs à 6. En revanche, les valeurs des autres liaisons hydrogène étaient inférieures à 3, ce qui indique que les changements de distances dans ces liaisons hydrogène sont des niveaux négligeables (tableau supplémentaire 3) .

Jusqu'à présent, trois et deux structures aux rayons X déterminées avec les techniques de cryo-piégeage et TR-SFX, en conséquence, ont été rapportées pour l'intermédiaire K13,14,15,16,17,18,19. Bien que la conformation rétinienne dans la plupart des structures ait pris des conformations déformées comme prédit par les données spectroscopiques30, ces données ont montré une grande variation dans les structures cristallographiques (Fig. 5a). Le degré de différence ne semblait pas dépendre de la méthode utilisée pour produire l'intermédiaire K. Les écarts les plus importants ont été trouvés dans les positions des atomes C13, C14 et C20 du rétinal. En conséquence, parmi les différentes structures, la variation était d'environ 60 ° pour C13-C14 et C15-Nζ, tandis que les variations pour les autres angles de torsion étaient d'environ 40 ° pour les angles de torsion de la chaîne polyène rétinienne (Fig. 6 supplémentaire ). Ces variations étaient significativement plus importantes que celles de l'état fondamental, indiquant l'absence de paramètres structurels fiables pour l'intermédiaire K (Fig. 5b). Dans notre structure, les angles de torsion de C13−C14 et C15−Nζ étaient respectivement de −38° et 143°, et les écarts types calculés à partir de trois structures (Crystals I−III) étaient de 14° et 11°, respectivement (Tableau complémentaire 4 ). Ces valeurs étaient au centre des autres résultats du graphique (Fig. 5b). Les structures les plus proches dans le tracé de l'angle de torsion étaient 6G7K18 et 1M0K14. Bien que les positions des atomes C13, C14 et C20 dans 6G7K18 soient proches de celles de nos résultats, celles de 1M0K14 étaient assez différentes. Cette différence a été causée par la planéité de la chaîne polyène entre C9 et C13. Ces écarts par rapport à 180 ° ont également contribué à la courbure de la chaîne polyène, entraînant la conformation en forme de S.

a Superposition de diverses structures K. Atomes de carbone dans 1QK0 rapportés par Edman et al.13, 1M0K par Schobert et al.14, 1IXF par Matsui et al.15, 6G7K par Nogly et al.18, et 6GA6 par Nass Kovacs et al.19, 7Z0C par Borshchevskiy et al.16 et 7XJC rapportés dans ce travail sont colorés en vert, jaune, cyan, orange marine et magenta, respectivement, tandis que les atomes d'azote (bleu) sont en commun. b Distribution des angles de torsion des doubles liaisons conjuguées (C13−C14 et C15−Nς) dans la rétine. Les angles de torsion pour les structures K sont tracés sous forme de cercles pleins dans les mêmes couleurs que celles utilisées pour les atomes de carbone dans le panneau a, tandis que ceux des structures d'état fondamental correspondantes (1QKP13, 1M0L14, 1IW615, 6G7H18, 6RMK19, 7Z0916 et 7XJD) sont tracés sous forme de losanges remplis. Pour les structures K et de l'état fondamental de cette étude, les écarts-types calculés à partir de trois structures pour chacune sont représentés par des barres d'erreur sur les valeurs moyennes représentées par des cercles creux. Les points de données pour les structures respectives dans cette étude sont représentés par des croix.

En raison de la variété de la conformation du rétinal, des différences significatives ont également été observées dans les interactions entre le rétinal et les résidus environnants, tels que Trp182 et Tyr185 (Fig. 7 supplémentaire). L'une des structures K (1QK0) 13 présentait la manière d'interaction la plus différente par rapport à celle de notre structure (Fig. 7a supplémentaire). D'autre part, une autre structure K (6G7K) 18 semblait être la plus similaire à la nôtre en termes d'interactions autour de la rétine, tandis que des distances inhabituellement proches ont été trouvées entre la rétine et Tyr185 (Fig. 7d supplémentaire). De plus, une courte distance de 2,28 Å a également été observée dans la liaison hydrogène entre Tyr185 et Asp212. Étant donné que les positions des atomes dans la rétine étaient très similaires, la différence par rapport à notre structure K était due au degré de modifications structurelles de Tyr185 (Fig. 4a et Fig. 7d supplémentaire). Comme pour 7Z0C16, la taille des cristaux, les conditions expérimentales et l'âge de la mesure sont très similaires à ceux de 7XJC dans cette étude. Néanmoins, il existe des différences non négligeables au niveau des positions des atomes C13, C14 et C20 dans la rétine (Fig. 5a). Ceci est probablement dû à la différence d'angle de torsion de la liaison simple Cε−Nζ, plutôt qu'à la différence d'angles de torsion des doubles liaisons conjuguées dans la chaîne polyène du rétinal. Par conséquent, une différence marquée a résulté dans l'orientation du Nζ−H. Celles-ci peuvent également être une raison de différences significatives dans l'interaction avec Tyr185 (Fig. 4a et Fig. 7f supplémentaire). Une raison possible de la différence pourrait être le nombre de répétitions du changement bR↔K pendant la mesure des données de diffraction. Dans la collecte de données de diffraction de 7XJC, les données de diffraction de K + bR irradiées avec de la lumière verte ont d'abord été mesurées afin d'obtenir la structure K aussi exempte que possible de dommages aux rayons X, comme décrit ci-dessus. D'autre part, dans la collecte de données de 7Z0C, le bR↔K a été répété plusieurs fois avec des angles changeants19.

La structure complétée par des atomes d'hydrogène a été obtenue au moyen de calculs QM/MM à partir de notre structure K afin d'effectuer des recherches détaillées sur les interactions autour de la liaison SB. La structure optimisée a été examinée par le tracé d'interaction non covalente (NCI) qui est une isosurface du gradient de densité réduit calculé à partir d'une densité électronique ρ31,32. Il y avait une surface bleu-vert dans le tracé NCI entre le proton amide sur Nζ de Lys216, qui forme la liaison SB, et Oδ1 de Asp212, indiquant la présence d'une interaction relativement forte (Fig. 6a). Cette interaction peut avoir été encore renforcée par l'attraction électrostatique entre la charge positive à Nζ de Lys216 et la charge négative à Oδ1 de Asp212. De plus, l'interaction entre Nζ de Lys216 et W402 a également été observée sous la forme d'une surface bleu-vert. D'autre part, il y avait des surfaces vertes entre les atomes d'hydrogène de méthylène du Cε de Lys216 et les atomes d'oxygène et d'hydrogène de Thr89, indiquant la présence d'interactions attractives de van der Waals. De plus, une surface NCI verte a été observée entre le Cε de Lys216 et le Oδ1 de Asp85, suggérant une liaison hydrogène de type CH∙∙∙O33. Ainsi, il a été suggéré que la rotation des liaisons Cε-Nζ et Cδ-Cε était inhibée par ces interactions entre Cε et Nζ de Lys216 et les résidus environnants (Fig. 6b). En fait, la portion de chaîne polyène du rétinal dans l'intermédiaire K a montré des déviations par rapport aux 180° ou 0° qui devraient prendre malgré la double liaison, tandis que la chaîne latérale de Lys216 a montré peu de déviation malgré les liaisons simples (Fig. 2b).

a Le tracé NCI pour le côté EC de la liaison SB. Des atomes d'hydrogène sont ajoutés en fonction de l'optimisation avec le calcul QM/MM. L'isosurface à gradient de densité réduite à s(ρ) = 0,5 est ajoutée en tant que surfaces colorées. La nature de l'interaction peut être visualisée par la couleur selon la valeur de sign(λ2)ρ dans une unité atomique (e a0−3), où λ2 et sign(λ2) sont la deuxième valeur propre de la matrice de Hesse de ρ et son signe, respectivement. L'échelle de couleurs est donnée en bas à droite du panneau. Le bleu, le vert et le rouge correspondent respectivement à l'attraction, l'attraction faible et la répulsion. Les flèches bleues indiquent l'interaction entre les atomes H de Cε dans Lys216 et Thr89. La flèche verte indique l'interaction entre H de Cε dans Lys216 et Asp85. La flèche orange indique l'interaction entre H de Nς dans Lys216 et W402. La flèche violette indique l'interaction entre H de Nς dans Lys216 et Asp212. b Les interactions avec les résidus environnants (Asp85, Thr89 et Asp212) et Water402 empêchent la rotation de torsion au niveau des liaisons Nς – Cε et Cε – Cδ dans Lys216. c La courbe d'énergie potentielle de torsion pour la liaison Nς–Cε. Les angles de torsion dans K/bR et L sont ~+240° et +120°, respectivement. d La courbe d'énergie potentielle de torsion pour la liaison Cε – Cδ. Les angles de torsion dans K/bR et L sont respectivement d'environ +60° et -60°.

Bien que des structures à haute résolution d'autres états de bR aient été rapportées récemment16,25, celle de K est restée ambiguë malgré l'importance de la structure déformée dans le mécanisme de transport de protons. Cependant, sur la base de l'analyse structurelle de l'intermédiaire K à ~ 1, 3 Å dans cette étude, nous avons pu obtenir les modes d'interaction précis ainsi que la conformation du rétinien 13-cis déformé. En comparant la conformation rétinienne en K dans cette étude à celle d'une structure en L récente16, des changements significatifs dans les angles de torsion des liaisons C13-C14, C14-C15 et C15-Nζ ont été observés. Ce fait indique que la torsion de la chaîne polyène du rétinal dans l'intermédiaire K a été relâchée dans l'intermédiaire L. En plus de ces changements, les liaisons Cε-Nζ et Cδ-Cε ont tourné d'environ 120° pour former un autre isomère de rotation. Ainsi, l'intermédiaire K s'est avéré être stabilisé par les interactions entre Cε/Nζ et les résidus environnants. Cela a permis de mieux comprendre comment les rotations autour des liaisons Cε-Nζ et Cδ-Cε se produisent lors de la transition vers l'intermédiaire L. Nous pourrions ainsi interpréter que les sous-états de l'intermédiaire K dont l'existence a été suggérée sont générés en raison de changements dans l'angle dièdre de la chaîne polyène du rétinal et de la chaîne latérale de Lys216. Certains sous-états, tels que K0, KE et KL, ont été proposés dans l'intermédiaire K34,35,36. Certaines des diverses structures cristallographiques de K, qui sont différentes les unes des autres comme décrit ci-dessus, peuvent être de tels sous-états capturés par des conditions expérimentales légèrement différentes (tableau supplémentaire 1). Par conséquent, un examen des différences dans chaque structure peut fournir des informations sur les sous-états de l'intermédiaire K. Sur la base des seules différences dans l'interaction entre Nζ-H et W402 et/ou Asp212 (Fig. 8 supplémentaire), le changement près du SB peut être proposé comme J → 7XJC (ce travail) → 1M0K14 → 6GA619 → 1IXF15 → 6G7K18 → 7Z0C16 → 1QK013 → L. Cependant, il n'est pas possible de déterminer clairement la correspondance entre ceux-ci et les sous-états proposés jusqu'à présent. De plus, l'ordre ne peut pas expliquer les changements dans la distorsion de la rétine et le mouvement de Tyr185. En outre, certaines précautions sont nécessaires dans la discussion comme suit. 1QK013 et 1M0K14 ont été déterminés dans des analyses où les influences des dommages causés par les rayons X n'étaient pas suffisamment prises en compte. 1IXF15 a une résolution plus faible que les autres, malgré le fait que des efforts ont été faits pour examiner et supprimer les effets des dommages causés par les rayons X. Pour 1QK013, cependant, il existe une nette différence avec les autres intermédiaires K en ce qui concerne l'angle de rotation autour de la liaison Cε − Nζ (Fig. 6 supplémentaire). Ainsi, la possibilité que 1QK013 soit une capture expérimentale d'un sous-état (KL) proposé par une étude computationnelle37 est hautement plausible même en présence de tels problèmes. Ainsi, la rotation de la liaison Cε-Nζ peut se produire avant la rotation de la liaison Cδ-Cε. Cela peut correspondre au fait que la profondeur du potentiel autour de la liaison Cε−Nζ (~10 kJ/mol) n'est qu'environ la moitié de celle du potentiel autour de la liaison Cδ−Cε (~20 kJ/mol), en raison de la fait que Nζ n'a qu'un seul atome d'hydrogène (Fig. 6c, d).

Il existe deux scénarios pour le changement de liaison hydrogène entre Nζ et W402 lors de la rotation de la liaison Cε-Nζ. Le premier est le cas où cette liaison hydrogène est rompue par rotation. Dans ce cas, même après la rupture de la liaison hydrogène, la molécule d'eau W402 peut rester au voisinage de sa position d'origine par des liaisons hydrogène avec Asp85 et Asp212. Dans le second cas, en revanche, la liaison hydrogène entre Nζ et W402 est encore formée après la rotation de la liaison Cε-Nζ. W402 est par conséquent entraîné du côté CP par la liaison hydrogène comme suggéré par Kouyama et al.38. Dans ce cas, le clivage des liaisons hydrogène fortes entre W402 et Asp212 ou Asp85 doit se produire à ce moment. Compte tenu de la rotation autour de la liaison Cδ-Cε suivant immédiatement la rotation de la liaison Cε-Nζ, les atomes d'hydrogène méthylène de Cε peuvent perturber ces liaisons hydrogène. La migration de W402 lors de la transition de K à L devrait être étudiée plus avant par des calculs de dynamique moléculaire en référence à nos découvertes actuelles.

Il ne fait aucun doute que TR-SFX apporte une grande contribution à l'étude des changements de conformation des protéines. Cependant, les impulsions lumineuses intenses des lasers de pompe ont été utilisées comme déclencheur dans la détermination des intermédiaires de réaction dans TR-SFX39. Il a été souligné que la contribution des processus multiphotoniques dus à des densités de photons élevées peut être problématique dans de telles expériences40. Dans le cas de bR, l'influence de l'absorption multiphotonique par Trp182 a été considérée comme un problème40. Le mouvement des molécules d'eau loin de la rétine, telles que W401 et W406 dans K ou des intermédiaires antérieurs observés dans les résultats TR-SFX18,19, peut être influencé par cette absorption multiphotonique (Fig. 8d, e supplémentaire). Par conséquent, contrairement au cas des intermédiaires de photoréaction qui apparaissent après une longue période, comme l'intermédiaire M, les effets du flux de photons élevé des lasers de pompe doivent être pris en compte dans le cas de l'intermédiaire K, qui apparaît immédiatement après la photoisomérisation. En revanche, dans la présente étude, la structure intermédiaire K a été déterminée par la méthode de cryo-piégeage à l'aide de lasers (~0,1 W/cm2) avec une intensité lumineuse comparable à celle de la lumière solaire, donc ce problème d'absorption multiphotonique n'existait pas. Par conséquent, l'importance de l'intermédiaire K doit être soigneusement étudiée en utilisant des structures à la fois des méthodes résolues en temps et de cryo-piégeage. Cette étude peut fournir un point de départ pour discuter de la validité et des limites des résultats TR-SFX avec des lasers de pompe à haute intensité. Avant de pouvoir élucider le mécanisme détaillé de l'expression fonctionnelle des protéines photoactives, d'autres recherches approfondies combinées à des méthodes informatiques41 seront également nécessaires dans le domaine de la biologie structurale.

bR a été purifié à partir de la membrane violette de la souche R1 de H. salinarum (JMC9409) par un protocole standard1. Les cristaux de bR utilisés dans cette étude ont été préparés par la méthode LCP comme décrit précédemment25. En bref, 32 μL de la matrice LCP à base de monooléine additionnée de 1,6 % de squalane (Sigma-Aldrich) et de 8 % de tréhalose C16 (Dojindo) ont été mélangés avec 20 μL de solution de bR à 15 mg/mL. Chaque 2 μL du mélange a été immergé dans 40 μL de 2,0 M Na/K phosphate (pH 5,6) sur un micropont (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), et équilibré avec 500 μL de 2,0−2,5 M Na/K phosphate dans une plaque de cristallisation 24 puits. Les cristaux ont été récoltés après 6 à 12 mois. L'excès de matrice LCP entourant les cristaux de bR a été éliminé avec du squalane42. Immédiatement (en ~ 1 min) après adaptation à la lumière pendant plus de 5 min avec une lampe halogène blanche en plus de la lumière d'un microscope, les cristaux de bR ont été congelés avec un flux d'azote gazeux de 100 K et stockés dans un réservoir d'azote liquide.

Des expériences de diffraction ont été réalisées sur la ligne de lumière BL41XU de SPring-8. L'intermédiaire K du cristal I (350 × 350 × 30 μm3) a été accumulé par irradiation de la lumière d'un laser vert (532 nm, ~ 1 mW) pendant 5 min à 100 K. Le cristal a été occasionnellement tourné de 180° pendant le laser irradiation. La température a été abaissée à 15 K immédiatement après l'irradiation laser. Les données de diffraction pour l'intermédiaire K ont été recueillies avec un détecteur Eiger X 16 M (Dectris). La distance du détecteur, la longueur d'onde des rayons X et la taille du faisceau ont été fixées à 135 mm, 0,80 Å, 50 × 20 μm2, respectivement. Les données de diffraction pour 110 ° ont été recueillies avec la méthode de collecte de données hélicoïdale dans laquelle la plage d'oscillation et le temps d'exposition pour une image étaient de 0,2 ° et 0,2 s, respectivement. Les données de diffraction de l'état fondamental ont ensuite été collectées par les mêmes conditions de mesure à partir des cristaux identiques à 15 K, après irradiation de la lumière d'un laser rouge (678 nm, ~ 1 mW) pendant 5 min à 100 K. Les données pour le cristal II ont été collectées de la même manière que celles du cristal I. Uniquement pour le cristal III, les données de diffraction des rayons X de l'état fondamental ont été initialement collectées avant les données de l'intermédiaire K. La dose d'absorption de rayons X a été estimée avec le programme RADDOSE43. La dose a été estimée à 0,05 MGy pour un ensemble de données et à 0,1 MGy au total pour deux ensembles de données. La dose totale est inférieure à la dose limite à 15 K de 0,15 MGy estimée dans notre précédente étude25.

Toutes les données de diffraction ont été traitées avec le programme XDS44. Au début de l'analyse de la structure, la structure de l'état fondamental a été affinée pour chaque cristal en utilisant 5ZIL comme modèle initial25. L'accumulation de l'intermédiaire K a d'abord été vérifiée avec la carte de Fourier de différence Fo (K + bR) - Fo (bR) en utilisant les phases de la structure de l'état fondamental. F (K) et σ(F (K)) ont été extrapolés à l'aide des équations45

où f est le rapport de fraction de l'intermédiaire K. La valeur f a été déterminée à en juger par les caractéristiques de forme de la partie rétinienne sur la carte d'omission Fo(K)−Fc(K) et les facteurs de température de la rétine après l'affinement des ensembles de données extrapolés avec diverses valeurs f à l'aide du programme CNS46. Dans les calculs de raffinement, seules les coordonnées de la rétine et des résidus avec des densités sur la carte de Fourier de la différence Fo(K + bR) − Fo(bR) ont été déplacées. Les structures ont été corrigées avec le programme COOT47. La structure K de la valeur f la plus plausible a ensuite été affinée par rapport à l'ensemble de données extrapolées avec le programme SHELX48. La structure K a été utilisée dans le raffinement SHELX ultérieur contre F (K + bR), où les états K et fondamental ont été traités comme des doubles conformations. Quant à la fraction gémellaire, la valeur initiale a été estimée avec le test L49 avec le programme CTRUNCATE dans la suite de programmes CCP450. La fraction macle a été optimisée grâce aux calculs de raffinement pour l'état fondamental et les structures K extrapolées. D'autre part, la fraction de macles pour la structure K + bR n'a été optimisée que dans certaines étapes finales du raffinement SHELX. Les données jumelées sont traitées selon la méthode de Pratt et al. et Jameson dans le programme SHELX51,52,53. La structure raffinée a été vérifiée avec le programme MolProbity54. Toutes les figures moléculaires ont été préparées avec le programme PyMOL55.

Tous les résidus, la rétine et les 19 eaux du canal proton ont été sélectionnés comme cibles pour les calculs QM/MM. Les coordonnées initiales de l'état K ont été extrapolées à partir de 7XJC déterminées dans cette étude, tandis que celles de l'état bR provenaient de 5ZIL. Les états de protonation au pH de cristallisation (5,6) ont été estimés avec le programme PROPKA56. Des atomes d'hydrogène ont été ajoutés avec les programmes PDB2PQR57 et MAESTRO58. Les coordonnées des atomes H ont été optimisées sous le schéma QM/MM avec la suite de programmes GAMESS (US)59. La région QM comprend Tyr57, Arg82, Asp85, Trp86, Thr89, Trp182, Tyr185, Pro186, Asp212, Lys216, retinal, W401, W402 et W406 (Fig. 9a supplémentaire). Les calculs QM ont été effectués au niveau M06-2X/6-31(d,p) comme recommandé pour les rhodopsines contenant de la rétine60. La région MM a été traitée avec le champ de force CHARMM3661. Dans un premier temps, les atomes H des molécules d'eau ont été optimisés avec le calcul MM pur. Ensuite, seuls les atomes H de la région QM ont été optimisés en fixant les atomes non-H. Enfin, tous les atomes de la région QM ont été optimisés. Les valeurs rmsd entre la structure cristalline et la structure optimisée étaient de 0, 13 Å pour l'état K et de 0, 07 Å pour l'état fondamental, respectivement, pour les atomes non H de la région QM (Fig. 9b, c supplémentaires). Comme pour tous les atomes non-H des régions QM et MM, ces valeurs étaient de 0,33 Å et 0,27 Å. Les tracés NCI du gradient de densité réduit ont été calculés à partir des densités électroniques DFT à l'aide du programme NCIPLOT62. Les potentiels des liaisons Cε−Nζ et Cδ−Cε ont été calculés pour CH2 libre = NH−CH2−CH2−CH3 avec Psi4 en utilisant HF/6-31 G*63,.

Plus de 10 cristaux ont été testés dans l'expérience de diffraction, et les données de trois cristaux (cristaux I-III) ont été sélectionnées pour les analyses de structure basées sur la résolution. Les structures de l'état K et fondamental d'un cristal donnant les meilleures résolutions (Crystal I) ont été décrites dans le texte principal, tandis que les deux autres ont été données dans les documents supplémentaires. Les valeurs moyennes et les écarts-types des angles de torsion de la rétine calculés à partir des trois structures pour chacune sont représentés par des cercles creux et des barres d'erreur (Fig. 2b, Fig. 5b et Fig. 6 supplémentaire).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées et les facteurs de structure ont été déposés dans la Protein Data Bank sous les numéros d'accession 7XJC (pour bR+K), 7XJD (pour bR) et 7XJE (pour K extrapolé). Les données sources pour les chiffres se trouvent dans les données supplémentaires.

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Nous remercions MM. N. Hasegawa et Y. Imai pour leur aide dans ce travail. Nous remercions également le personnel de la ligne de lumière du BL41XU de SPring-8 pour leur aide dans les expériences de collecte de données (Proposition n° 2018B2706, 2019B2718, 2021A2753 à KT). Ce travail a été soutenu par la Kyoto University Foundation (à KT), la Takeda Science Foundation (à KT) et JSPS KAKENHI (No. JP 20H05220 à KT). H. salinarum a été obtenu auprès de la banque de cellules RIKEN BRC.

Département de chimie, École supérieure des sciences, Université de Kyoto, Kyoto, Sakyo-ku, 606-8502, Japon

Shoun Taguchi, Satomi Niwa, Hoang-Anh Dao, Yoshihiro Tanaka, Ryota Takeda, Shuya Fukai et Kazuki Takeda

Division de biologie structurale, Institut japonais de recherche sur le rayonnement synchrotron (JASRI), 1-1-1 Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japon

Kazuya Hasegawa

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KT a supervisé le projet. ST et KT ont conçu les expériences. Cristaux préparés par ST. ST, SN, KH et KT ont effectué des collectes de données. ST, SN, YT et KT ont effectué des analyses cristallographiques. H.-AD, RT et KT ont effectué des analyses de chimie quantique. ST, SN, H.-AD, SF, KH et KT ont discuté des résultats. ST et KT ont rédigé le projet initial, et SN et H.-AD ont révisé le projet. Tous les auteurs ont fait des commentaires sur le projet et ont consenti à la soumission de la version finale.

Correspondance à Kazuki Takeda.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Michael F. Brown et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Janesh Kumar, Véronique van den Berghe et Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Taguchi, S., Niwa, S., Dao, HA. et coll. Analyse détaillée de la rétine déformée et de son interaction avec les résidus environnants dans l'intermédiaire K de la bactériorhodopsine. Commun Biol 6, 190 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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Reçu : 10 juillet 2022

Accepté : 03 février 2023

Publié: 17 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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