Identification des antibiotiques en fonction des différences structurelles dans l'allosterie conservée de l'hème mitochondrial

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7591 (2022) Citer cet article

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Une correction de l'auteur à cet article a été publiée le 21 décembre 2022

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La résistance aux antimicrobiens (RAM) est un problème de santé mondial. Malgré les énormes efforts déployés au cours de la dernière décennie, les menaces de certaines espèces, notamment Neisseria gonorrhoeae résistante aux médicaments, continuent d'augmenter et deviendraient incurables. Le développement d'antibiotiques avec un mécanisme d'action différent est sérieusement nécessaire. Ici, nous avons identifié un site inhibiteur allostérique enfoui dans les hème-cuivre oxydases mitochondriales eucaryotes (HCO), les enzymes respiratoires essentielles à la vie. La conformation stérique autour de la poche de liaison des HCO est hautement conservée chez les bactéries et les eucaryotes, mais ces derniers ont une hélice supplémentaire. Cette différence structurelle dans l'allosterie conservée nous a permis d'identifier rationnellement des inhibiteurs bactériens spécifiques de HCO : un composé antibiotique contre Neisseria gonorrhoeae résistant à la ceftriaxone. La dynamique moléculaire combinée à la spectroscopie Raman de résonance et à la spectroscopie à flux arrêté a révélé une obstruction allostérique dans le canal d'accès au substrat comme mécanisme d'inhibition. Notre approche ouvre de nouvelles voies dans la modulation des fonctions des protéines et élargit nos options pour surmonter la RAM.

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est un problème de santé mondial1. De nombreux efforts ont été déployés pour réduire le fardeau des périls liés à la RAM dans le monde depuis 2013, mais les menaces de certaines espèces continuent d'augmenter malgré tout : Neisseria gonorrhoeae résistante aux médicaments est l'une des cinq menaces urgentes2,3. La résistance à la ceftriaxone, la dernière option pour un antibiotique empirique de première intention contre Neisseria gonorrhoeae dans la plupart des pays, a été signalée et continue d'émerger dans le monde4. L'infection gonococcique pourrait devenir incurable en raison d'un degré élevé de RAM, ce qui augmenterait les complications graves : infertilité, grossesse extra-utérine et augmentation de la transmission du VIH. L'émergence d'agents pathogènes résistants aux antibiotiques actuellement disponibles est très alarmante ; ainsi, le développement d'options de traitement est impératif pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens.

La chaîne respiratoire a récemment fait l'objet d'une attention scientifique considérable en tant que cible potentielle des antibiotiques. Comme arme pour vaincre la résistance aux antimicrobiens, des composés ciblant la chaîne respiratoire ont été approuvés ou sont entrés dans des essais cliniques, par exemple des médicaments contre les parasites, les champignons et particulièrement le Mycobacterium tuberculosis résistant aux médicaments5,6,7,8,9,10. Cependant, la plupart d'entre eux sont des inhibiteurs compétitifs des sites orthostériques. Les enzymes respiratoires étant essentielles à la vie, leur structure de base est généralement conservée d'une espèce à l'autre. La similitude structurelle et la similitude du substrat avec les protéines hôtes sont des risques de réactivité croisée, ce qui pourrait être une cause d'effets secondaires11. Par conséquent, un inhibiteur allostérique est un choix plus faisable car les sites allostériques sont évolutivement moins conservés dans la séquence d'acides aminés que les sites orthostériques, améliorant théoriquement la sélectivité et réduisant la toxicité12,13. Cependant, une recherche systématique et stratégique d'inhibiteurs allostériques n'a pas encore été établie, en particulier contre les protéines membranaires ; la plupart des enzymes respiratoires sont des protéines membranaires.

Les HCO sont des enzymes respiratoires terminales présentes dans les trois domaines de la vie : bactéries, archées et eucaryotes. Les HCO reçoivent des électrons de la chaîne respiratoire et réduisent l'oxygène moléculaire en eau. Cette réaction exergonique est couplée à un pompage de protons à travers la membrane, ce qui contribue à maintenir la force motrice du proton qui est ensuite utilisée pour la production d'ATP14,15,16,17,18. Les HCO sont des complexes multi-sous-unités et leur constitution varie selon les espèces; cependant, la sous-unité I est une sous-unité catalytique commune à tous les HCO. Il contient un hème à bas spin et un centre binucléaire (BNC), le site catalytique formé par un hème à haut spin et un ion cuivre. L'hème à faible spin reçoit d'abord les électrons et les transfère au BNC pour la réduction de l'oxygène16,17,18,19.

Les eucaryotes sont issus de la symbiose entre les alphaprotéobactéries et les archées20. Par conséquent, les sous-unités I à III codées par l'ADN mitochondrial de la cytochrome c oxydase mitochondriale (mtCcO), analogues aux HCO eucaryotes, sont des descendants des enzymes respiratoires des bactéries20,21 et des résidus fonctionnellement importants, et donc leur structure de base est conservée, bien que le les résidus restants ne sont pas les mêmes. De plus, le mtCcO de mammifère possède 10 sous-unités supplémentaires codées par l'ADN génomique. Les rôles physiologiques de ces sous-unités ne sont pas entièrement élucidés16. Les structures de base des protéines fondamentales telles que les ARN polymérases ou les ribosomes sont également similaires entre les espèces; curieusement, ils ont acquis des sous-unités supplémentaires qui modulent leur fonction au cours de l'évolution moléculaire22,23. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que la surface de la structure centrale des HCO, qui sont recouvertes d'hélices supplémentaires chez les mammifères, pourrait contenir des sites allostériques, régulant leur activité positivement ou négativement. L'existence d'une hélice supplémentaire dans le mtCcO de mammifère rend les poches distinctes des HCO bactériens.

Dans ce travail, nous identifions un site inhibiteur allostérique enfoui à l'intérieur de mtCcO eucaryote. La conformation stérique autour de la poche de liaison des HCO est hautement conservée chez les bactéries et les eucaryotes, mais ces derniers ont une hélice supplémentaire. La différence structurelle dans l'allosterie conservée nous permet d'identifier rationnellement les inhibiteurs bactériens spécifiques de HCO : un composé antibiotique contre Neisseria gonorrhoeae résistant à la ceftriaxone.

Pour tester cette hypothèse, nous devons d'abord identifier un site inhibiteur allostérique. Nous avons commencé avec des inhibiteurs de mtCcO de mammifères obtenus par criblage aléatoire de composés. Nous avons précédemment découvert qu'une protéine endogène interagit directement avec mtCcO et module allostériquement l'activité de mtCcO24,25. Cette découverte nous a amenés à effectuer un criblage aléatoire de composés qui modulent l'activité de mtCcO ; nous avons identifié des inhibiteurs de mtCcO, chimiquement distincts des inhibiteurs connus, notamment le monoxyde de carbone, l'oxyde nitrique (NO) ou les cyanures. Nous avons sélectionné plusieurs inhibiteurs allostériques après avoir étudié leur cinétique enzymatique (Fig. 1a–d supplémentaire). Nous avons ensuite tenté d'obtenir des structures cristallines complexes de mtCcO et de nos inhibiteurs. Nous nous sommes concentrés sur T113 ci-après car son site de liaison était enfoui dans une hélice spécifique aux mammifères, COX7C (Fig. 1a, b). Les données de diffraction des rayons X avec une résolution de 2,2 Å ont été obtenues à partir d'un cristal de mtCcO imbibé de T113. Nous avons également déterminé l'apo-structure de mtCcO dans les mêmes conditions de préparation (tableau supplémentaire 1). La structure complexe obtenue a montré un site de liaison de composé clair qui a donné une densité électronique supplémentaire par rapport à la protéine, clairement trouvée à l'intérieur du mtCcO (Fig. 2a supplémentaire). La carte différentielle Fo (T113) – Fo (DMSO) a confirmé que cette densité électronique ne provenait pas de molécules d'eau ou de lipides et a montré la différence la plus élevée (Fig. 2b supplémentaire). La poche de liaison était différente du site de liaison de l'oxygène moléculaire ou du cytochrome c, de la voie de transfert d'électrons, de la voie des protons ou du canal d'accès à l'oxygène16,19, suggérant que T113 est un véritable inhibiteur allostérique.

une structure aux rayons X de mtCcO avec T113. La carte de densité électronique (2Fo – Fc), contournée à 1σ, est représentée à gauche. Le modèle de ruban de mtCcO avec T113 dans la sphère est illustré à droite. T113 était recouvert de COX7C (rouge), caché de la surface. b T113 était entourée de 4 hélices transmembranaires (TM1–3, COX7C) et enterrée depuis la surface, vue depuis l'espace intermembranaire. La surface moléculaire des protéines est représentée en gris dans la vue rapprochée. Trois hélices de la sous-unité I entourant le site allostérique sont représentées en bleu foncé, les autres hélices de la sous-unité I en bleu pâle, la sous-unité COX7C dans mtCcO est représentée en rouge.

Trois hélices sur quatre entourant le site allostérique de mtCcO appartiennent à la sous-unité I, commune aux HCO. De plus, nous avons remarqué que la conformation stérique des hélices près de l'hème à faible spin est bien conservée dans les HCO bactériens (Fig. 2a et Fig. 3 supplémentaire). Ces observations nous ont amenés à supposer que nous pouvions raisonnablement filtrer les inhibiteurs allostériques à partir de dérivés de nos inhibiteurs de mtCcO, qui ciblent probablement le site allostérique correspondant des oxydases bactériennes.

a Sites allostériques de mtCcO mitochondrial (à gauche) et E. coli bo3 UqO (au centre). Les hélices de la sous-unité I sont représentées en bleu, TM0 de la sous-unité I en violet, la sous-unité COX7C est représentée en rouge et les autres hélices en jaune. Les vues fusionnées sont présentées (à droite) avec E. coli bo3 UqO en gris. COX7C est suffisamment proche pour couvrir l'inhibiteur. Toutes les hélices de la sous-unité I sont fusionnées entre mtCcO et E. coli bo3 UqO sauf TM0. b Dépistage de 434 produits chimiques à 50 µM contre E. coli bo3 UqO. Les données sont présentées sous la forme d'une moyenne d'un doublon. c Inhibition dose-dépendante de N4 spécifique de l'activité enzymatique bo3 UqO. Les données sont présentées sous la forme d'une valeur moyenne des répétitions techniques sur deux expériences indépendantes. d Analyse cinétique de bo3 UqO avec du DMSO et une molécule de N4 25 µM. Les lignes d'ajustement sont calculées en utilisant l'équation de Michaelis – Menten avec le modèle d'inhibition non compétitive. Les données sont présentées sous la forme d'une valeur moyenne de répétition technique. La reproductibilité a été confirmée par deux expériences indépendantes. Les données source sont disponibles sous forme de fichier de données source.

Pour la préparation d'une bibliothèque personnalisée, nous avons appliqué le criblage de composés in silico provenant de deux inhibiteurs de mtCcO, dont T113 et T151, que nous avons obtenus lors du criblage initial à haut débit ; Il a également été constaté que T151 se liait au site allostérique (Fig. 1d supplémentaire). Des composés structurellement similaires à ceux-ci ont été principalement collectés par plusieurs algorithmes de recherche basés sur des ligands à partir de 80 millions de composés disponibles dans le commerce. Ensuite, notre algorithme maison les a intégrés, les a classés et a choisi la première série de 285 composés26,27. Nous avons ajouté le deuxième ensemble de 149 composés choisis par simulation d'amarrage, qui a criblé les mêmes 80 millions de composés contre la poche allostérique de mtCcO. Au total, nous avons établi une bibliothèque personnalisée composée de 434 composés qui ont une forte probabilité de se lier au site allostérique conservé pour les HCO. Nous avons testé cette bibliothèque contre la mtCcO et, par conséquent, 47 composés ont inhibé la mtCcO de plus de 40 % à 50 μM (11,4 %), supérieur au taux de réussite habituel du dépistage aléatoire, vérifiant que notre bibliothèque personnalisée concentrait les inhibiteurs de la mtCcO (Fig. 4a).

Nous avons utilisé E. coli bo3 ubiquinol oxydase (bo3 UqO) pour tester notre hypothèse en tant que HCO bactérien modèle. Notre bibliothèque personnalisée a été criblée contre bo3 UqO et nous avons obtenu 15 composés à succès qui ont montré une inhibition > 40 % pour bo3 UqO à 50 µM (Fig. 2b). Parmi eux, huit inhibiteurs communs pour mtCcO et bo3 UqO, et plus important encore, deux inhibiteurs spécifiques pour bo3 UqO, ont été acquis avec succès (Fig. 2c). Comme prévu, l'un de ces inhibiteurs, N4, correspondait bien à la courbe inhibitrice allostérique évaluée par l'équation de Michaelis – Menten (Fig. 2d).

Pour obtenir une preuve directe que N4 se lie au site allostérique correspondant, nous avons déterminé la structure de bo3 UqO lié à N4 avec un fragment Fab à une résolution de 3,0 Å en utilisant la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) (Fig. 3a, Fig. 5e supplémentaire– h et tableau supplémentaire 2). Nous avons également déterminé l'apo-structure de bo3 UqO à 3, 1 Å dans les mêmes conditions de préparation (Fig. Supplémentaire 5a – d). Les cartes différentielles entre les structures holo et apo ont démontré une densité supplémentaire explicite, et cette densité était la principale différence trouvée (Fig. 5i supplémentaire). Notamment, le site de liaison était exposé à la surface et adjacent à l'hélice transmembranaire 1 (TM1), TM2 et TM3 de la sous-unité I, ce qui corrobore fortement notre hypothèse (Fig. 3b, c). Il y avait des liaisons hydrogène entre Asp75, Arg71 et N4. La surface de potentiel électrostatique des sites de liaison a montré que bo3 UqO a une surface plus hydrophile que mtCcO, ce qui suggère qu'il est peu probable que T113 hydrophobe se lie à bo3 UqO (Fig. 3d). Pendant ce temps, N4 relativement hydrophile n'est pas un liant réalisable pour la poche allostérique mtCcO, un environnement plus hydrophobe, expliquant que N4 est un dérivé de T113, mais ils sont des inhibiteurs mutuellement exclusifs pour bo3 UqO ou mtCcO, respectivement. Les mutants pour les résidus d'acides aminés autour de l'inhibiteur dans la structure ont démontré un changement significatif de l'effet inhibiteur, confirmant que N4 se lie définitivement à bo3 UqO au niveau de la poche (Fig. 5j supplémentaire).

une carte de densité Cryo-EM (à gauche) et le modèle de ruban (à droite) de bo3 UqO en complexe avec N4 (rouge à gauche, sphère à droite). Le site allostérique de bo3 UqO est exposé. b Molécule N4 dans le site allostérique de bo3 UqO. La carte de densité cryo-EM autour de N4 est représentée en rouge. Les interactions moléculaires entre Asp75, Arg71 et N4 sont représentées par des lignes pointillées. c N4 est accessible depuis la surface. La surface moléculaire de la protéine au plan de Fe dans l'hème b est représentée en gris. L'ensemble de la molécule N4 a été présenté. d La surface de potentiel électrostatique du site allostérique de bo3 UqO (à gauche) et de mtCcO (à droite). e Inhibition de la croissance par N4 pendant 24 h de culture d'E. coli de type sauvage (Wild), de la souche bo3 UqO-knockout (Δbo3) et de la souche bo3 UqO-dépendante (Δbd). f Un test de viabilité dépendant du temps et de la concentration. Une ligne pointillée indique l'inoculation (1 × 105 UFC/ml). Les données sont confirmées par triple exemplaire biologique (e) ou double (f). La couleur des hélices est identique à celle de la Fig. 2. Les données source sont disponibles sous forme de fichier de données source.

Un inhibiteur spécifique des HCO bactériens pourrait avoir le potentiel d'être un antibiotique. Pour tester cette possibilité, nous avons évalué l'inhibition de la croissance d'E. coli par N4. Chez E. coli, il existe deux branches pour les oxydases terminales de la chaîne respiratoire, bo3 UqO et la cytochrome bd oxydase (bd UqO). E. coli utilise la bo3 UqO en conditions aérobies, alors qu'elle utilise préférentiellement la bd UqO en conditions hypoxiques, par adaptation à l'environnement28. Dans E. coli de type sauvage, il n'y avait aucun effet de N4 sur la croissance; cependant, il a significativement diminué la croissance d'E. coli dans la souche bo3 UqO-dépendante (Fig. 3e). Cette inhibition de la croissance a été annulée dans la souche knock-out bo3 UqO, confirmant que l'inhibition de la croissance par N4 était le résultat de l'inhibition de HCO et non d'un effet non spécifique. Pour distinguer les effets bactéricides et bactériostatiques du composé, nous avons effectué un test de comptage des colonies et constaté que l'effet de notre inhibiteur, N4, sur E. coli est bactériostatique (Fig. 3f).

Ensuite, pour étendre nos découvertes, nous avons testé la NO réductase dépendante du quinol (bb3 qNOR), un membre de la famille éloignée de HCO de la bactérie pathogène Neisseria. Dans le genre Neisseria, l'émergence et la propagation de N. gonorrhoeae multirésistant aux médicaments est un problème de santé mondial considérable29. Le qNOR réduit le NO en protoxyde d'azote (N2O) et est une enzyme critique dans la dénitrification, qui oxyde les composés azotés pour produire de l'énergie dans des conditions anoxiques30. La dénitrification bactérienne joue également un rôle essentiel en les protégeant du NO exogène produit par les cellules immunitaires de l'hôte, étant ainsi impliquée dans la pathogénicité de plusieurs espèces bactériennes, dont N. meningitidis et N. gonorrhoeae31,32. Ceux-ci suggèrent que qNOR dans Neisseria peut être une cible médicamenteuse. Nous avons utilisé N. meningitidis qNOR car les séquences d'acides aminés de N. meningitidis qNOR et de N. gonorrhoeae qNOR sont identiques à 98 %, en particulier à 100 % dans la région transmembranaire, et surtout la structure de N. meningitidis qNOR a été résolue33. Nous avons confirmé que la conformation stérique de trois hélices (TM 3–5 dans bb3 qNOR) autour de l'hème à faible spin est également conservée dans bb3 qNOR (Fig. 4a)34. Nous avons utilisé la même approche pour bb3 qNOR que pour bo3 UqO. Tout d'abord, nous avons criblé notre bibliothèque personnalisée contre bb3 qNOR et obtenu 52 composés à succès qui ont montré une inhibition > 50 % de bb3 qNOR à 50 µM (Fig. 4b). Parmi eux, nous avons trouvé un inhibiteur spécifique de bb3 qNOR, Q275. Q275 n'a croisé ni mtCcO ni bo3 UqO (Fig. 4c). Q275 n'a pas affecté la respiration cellulaire des cellules de mammifères, ni leur viabilité cellulaire (Fig. 4d, e). Nous avons confirmé que Q275 a un mode d'inhibition allostérique (Fig. 4f). De plus, des mutants substitués par des acides aminés autour du site allostérique correspondant de bb3 qNOR ont montré un changement considérable dans l'effet inhibiteur, confirmant que Q275 se lie à bb3 qNOR au niveau de la poche (Fig. 4g).

a La conformation stérique autour de l'hème à faible spin est conservée dans bb3 qNOR (PDB : 6fwf). Une ombre rouge indique le site allostérique, distinct du site de liaison du quinol. b Criblage de 434 produits chimiques à 50 µM sur N. meningitidis bb3 qNOR (axe x) et E. coli bo3 UqO (axe y). Q275 est un inhibiteur spécifique de bb3 qNOR, représenté en vert. c Inhibition dose-dépendante et spécifique de Q275 sur l'activité bb3 qNOR. d Q275 n'a aucun effet sur le taux de consommation d'oxygène dans les cellules de mammifères. N = 6 répétitions techniques pour chaque groupe et reproduites dans deux expériences indépendantes. e Q275 ne montre aucune cytotoxicité évaluée dans les cardiomyocytes de rat. NC; DMSO, PC ; 1% Triton X-100. N = 6 répétitions techniques pour le DMSO, 3 pour les autres groupes. La reproductibilité a été confirmée par deux expériences indépendantes. f Analyse cinétique de bb3 qNOR avec DMSO et 10 µM de molécule Q275. Les lignes d'ajustement sont calculées en utilisant l'équation de Michaelis – Menten avec le modèle d'inhibition non compétitive. g L'effet de la substitution d'acides aminés de bb3 qNOR. Les positions de Val293, Val289 et Trp334 sont indiquées en (a). h Concentration minimale inhibitrice (CMI) de Q275 contre la souche de référence de N. gonorrhoeae WHO F et un FC428 résistant à la ceftriaxone. Du nitrite de sodium (20 mM) a été ajouté pour imiter une condition de NO. Les données représentent des expériences en double. i Comptage des colonies 24 h après le traitement Q275 de N. gonorrhoeae WHO F, FC428 et déficient en norB des deux souches. Du nitrite de sodium (20 mM) a été ajouté pour imiter une condition de NO. Une ligne pointillée indique l'inoculation (5 × 105 UFC/ml). c, f, g Les données sont présentées sous la forme d'une valeur moyenne des répétitions techniques sur trois (f, g) expériences indépendantes. Les données source sont disponibles sous forme de fichier de données source.

Enfin, nous avons testé l'effet antimicrobien du Q275 contre une souche cliniquement isolée de N. gonorrhoeae résistante à la ceftriaxone (FC428) ; la propagation de la N. gonorrhoeae super-résistante est devenue un grave problème de santé mondiale4. Notamment, Q275 a démontré des effets antimicrobiens contre le FC428 ainsi que la souche de référence (WHO F) dans des conditions de défi NO (attaque des cellules immunitaires), imitant l'environnement intravital infectieux (Fig. 4h). Nous avons établi des souches déficientes en norB, codant pour qNOR, dans les contextes WHO F et FC428. Dans des conditions de défi NO (NaNO2 20 mM), les souches déficientes en norB dans WT et FC428 ne se sont pas développées, ce qui confirme en outre que l'inhibition de la croissance est médiée par qNOR. Pour faire la distinction entre les effets bactéricides et bactériostatiques en utilisant ces souches déficientes en norB, nous avons effectué un comptage des colonies après exposition à NaNO2 et avons constaté que le ciblage de qNOR dans N. gonorrhoeae est bactériostatique (Fig. 4i). Ces résultats suggèrent que notre approche a développé un inhibiteur spécifique contre un HCO bactérien pathogène à la demande avec une gamme étroite de spécificité, ayant le potentiel thérapeutique pour lutter contre la RAM.

Nous nous sommes ensuite concentrés sur le mécanisme inhibiteur. Le site de liaison de T113 sur mtCcO formait un tunnel étroit entouré de quatre hélices au total (Fig. 1b). La carte différentielle Fo(T113)–Fo(DMSO) a révélé plusieurs différences dans la structure de mtCcO déclenchée par la liaison de l'inhibiteur : le site de sortie de la voie du proton (Asp50, Asp51), une chaîne latérale de Ser382 de TM10 en sous-unité I et le groupe hydroxyfarnésyléthyle de l'hème a (Fig. 2b supplémentaire). Ce sont les sites où des changements structurels ont été signalés entre les formes réduites et oxydées de mtCcO, ce qui soulève la possibilité que T113 ait pu réduire mtCcO35. Pour tester cette possibilité, nous avons analysé la signature de mtCcO réduite par le dithionite ou par T113. Comparé à un état entièrement réduit induit par le dithionite, le mtCcO mélangé à T113 a montré une signature minimale de changement réducteur dans la bande de Soret et une augmentation des spectres d'absorption d'environ 600 nm, qui sont caractéristiques des hèmes réduits, suggérant que T113 n'est pas un réactif réducteur. (Fig. 6 supplémentaire). Par conséquent, le changement structurel que nous avons observé n'explique pas complètement le mécanisme d'inhibition.

Dans le mécanisme de l'allosterie, une liaison effectrice transmet le signal au site fonctionnel, le site orthostérique, par une transition d'ensembles conformationnels, souvent difficile à capter par l'analyse structurale en raison de son caractère instantané ou d'une éventuelle contrainte de cristallisation36. Par conséquent, pour obtenir un aperçu mécaniste, nous avons appliqué une simulation de dynamique moléculaire (DM) de mtCcO avec ou sans l'inhibiteur. Dans l'ensemble, les simulations MD avec l'inhibiteur (holo-MD) n'ont pas montré de déformation structurelle significative. Notamment, les trajectoires moyennes avec l'inhibiteur ont montré que TM2 de la sous-unité I, l'une des quatre hélices formant la poche de liaison de l'inhibiteur, se penchait dans la direction de TM5/6, bien que TM3 n'ait pas changé entre les holo- et apo-MD (Fig. 5a–c). Ce mouvement suggère que le canal de l'oxygène moléculaire, la cavité hydrophobe entourée entre TM2/4 et TM5/6, est resserré. L'holo-MD a démontré que la distance entre Glu242 et Ile66, qui font tous deux face au canal d'oxygène et forment une partie de section transversale minimale, se rétrécissait en présence de l'inhibiteur. En revanche, la distance entre Ile312 et Val287, qui font face à un chemin de sortie pour l'eau produite, n'a pas changé (Fig. 5c, d). De plus, nous avons effectué des simulations supplémentaires avec élimination du ligand après MD lié au ligand (Re-apo MD). Re-apo MD a démontré que TM2 s'est détendu à la structure initiale de l'apo, bien que le changement dans le canal d'oxygène ne se soit pas relâché pendant le Re-apo MD, suggérant que l'effet sur TM2 de l'inhibiteur qui est à côté de TM2 est plus direct que sur le canal d'oxygène. Ces données suggèrent que T113 pourrait interférer avec l'accès de l'oxygène au BNC, inhibant ainsi la réaction enzymatique.

a Axes de TM2 et 3 dans un instantané représentatif d'une trajectoire d'apo-MD, holo-MD et Re-apo MD. Les axes ont été calculés par les outils UCSF Chimera et représentés par des cylindres. Les molécules d'hème a et T113 ont été représentées sous forme de bâtonnets verts. b Histogrammes de distribution de l'angle pour TM2 et 3. c La région focalisée dans la simulation MD. Les trajets du canal d'oxygène (rouge) et du canal d'eau (vert) ont été calculés par CAVER et représentés par des sphères continues. TM1-6 dans la sous-unité I est représentée en bleu foncé et les autres hélices de la sous-unité I en bleu pâle, la sous-unité COX7C dans mtCcO est représentée en rouge et les autres hélices en jaune. d Histogrammes de distribution de la distance entre Glu242-Ile66 dans le canal d'oxygène et de la distance entre Ile312-Val287 dans le canal d'eau. Les flèches montrent le mouvement de TM2 par T113 en (a, c). Les lignes pointillées en b et d indiquent la valeur médiane. e Les spectres Raman de résonance excitée à 441,6 nm des hèmes mtCcO ((i), (iii)) sans et ((ii), (iv)) avec N62. L'échantillon de mtCcO a été irradié au laser deux fois avec une incubation à l'obscurité de 10 minutes entre les deux. Les spectres ((1); bleu) et ((2); vert) ont été obtenus de 0 à 3 et 27 à 30 min lors de la première irradiation de 30 min. Après 10 min d'incubation dans l'obscurité, des spectres ((3) noir) et ((4) rouge) ont été obtenus de 0 à 3 min et de 27 à 30 min lors de la 2e irradiation de 30 min. La puissance du laser était de 1 mW pour ((i), (iii)) et de 0,1 mW pour ((ii), (iv)). f Une expérience à flux arrêté a montré que N62 inhibait la liaison du CO à CcO cinq fois plus lentement que le témoin. Les changements d'absorbance à 440 nm sont associés à la liaison du CO au mtCcO réduit. g Changements d'absorbance à 430 nm associés à la liaison du CO à la bo3 UqO réduite de type sauvage. Les lignes d'ajustement sont calculées par un modèle de décroissance à une phase. La plage de données est présentée sous la forme d'un écart type de quatre répétitions pour CcO et de trois répétitions pour bo3 UqO. Les données source sont disponibles sous forme de fichier de données source.

Pour tester si T113 a un effet allostérique dans le canal de l'oxygène, nous avons effectué la spectroscopie Raman par résonance, une méthode sensible pour détecter les changements structurels qui ne peuvent pas être évalués par l'analyse structurelle des cristaux aux rayons X. Comme T113 a une autofluorescence, nous avons criblé ses dérivés et choisi N62 en raison de sa plus grande affinité sans autofluorescence (Fig. 4b, c supplémentaires). Nous avons confirmé que N62 liait le même site de liaison en co-cristallographie (Fig. 4d supplémentaire) et a donné une petite différence autour de 440 nm dans l'absorption de l'hème similaire à celle avec T113 (Fig. 4e supplémentaire). Nous avons utilisé N62 pour les analyses spectroscopiques Raman ci-après. Auparavant, il a été rapporté que la lumière visible induit une photoréduction de mtCcO, où l'hème a est initialement réduit, suivi de l'hème a337. La figure 4e représente les spectres de résonance Raman de mtCcO avec et sans N62, en se concentrant sur la photoréduction des hèmes. La bande Raman de résonance à 1356/1372 cm−1 est attribuable au mode ν4 des hèmes (hème a et hème a3), indicateur de l'état redox : 1356 cm−1 pour l'état réduit, 1372 cm−1 pour le état oxydé38. Dans des conditions de contrôle sans N62, une irradiation laser à une puissance laser de 1 mW a démontré une photoréduction des hèmes. Lorsque l'irradiation a été arrêtée, l'oxygène disponible a provoqué la restauration des hèmes oxydés, inversant les bandes du marqueur redox. La réirradiation avec le laser a de nouveau démontré une réduction des hèmes (Fig. 5e (i)). En revanche, mtCcO avec N62 a affiché un comportement de photoréduction différent. Avec N62, une réduction comparable des hèmes a été observée avec une faible puissance laser de seulement 0,1 mW. Notamment, l'arrêt de l'irradiation au laser n'a pas diminué la bande du marqueur de réduction et la réirradiation a montré une nouvelle augmentation de celle-ci (Fig. 5e (ii)). Ces données indiquent que le N62 inhibe la réoxydation des hèmes photoréduits par l'oxygène. Pour sonder plus directement la liaison à l'oxygène, nous avons ensuite analysé le mode d'étirement Fe-His (νFe-His) de l'hème a3, le site de liaison à l'oxygène, à 215 cm-1, représentant l'état réduit à 5 coordonnées de l'hème a3. Les bandes de 215 cm-1 disparaîtront lorsque l'oxygène moléculaire se lie à l'hème a3. mtCcO sans N62 présentait un cycle d'augmentation/diminution de la bande de 215 cm-1 (Fig. 5e(iii)) ; cependant, mtCcO avec N62 a démontré une augmentation continue dans la bande de 215 cm-1 (Fig. 5e (iv)), ce qui fournit une preuve expérimentale que N62 inhibe la liaison de l'oxygène à l'hème a3. L'inhibition de la réoxydation de l'hème a3 par l'oxygène abaisse le seuil de la photoréduction, indiquant que le changement structurel du cristal de mtCcO a vraisemblablement été causé par une réduction induite par les rayons X lors de l'acquisition des données.

Pour renforcer encore l'effet de l'inhibiteur sur le canal de l'oxygène, nous avons réalisé une expérience à flux arrêté dans laquelle nous avons pu évaluer directement l'accès du monoxyde de carbone (alternative à l'oxygène moléculaire) au centre binucléaire39. Comme le montre la figure 5F, N62 a inhibé la liaison du CO à CcO cinq fois plus lentement que le témoin. Par conséquent, nous avons conclu que l'inhibition allostérique dans le canal d'accès à l'oxygène joue un rôle majeur dans leur inhibition de mtCcO.

Il est plausible que l'allosterie que nous avons trouvée dans mtCcO soit également préservée entre les HCO bactériens et leurs inhibiteurs. À cette fin, nous avons créé une seule substitution d'acide aminé dans les acides aminés qui font face au canal d'oxygène de bo3 UqO, qui peut être manipulée génétiquement. Parmi les mutants réalisés, des substitutions moins volumineuses de Glu286 et Phe112, qui correspondent à Glu242 et Phe67 dans mtCcO (Figs. 3c et 5c), ont réduit l'effet inhibiteur de N4 (Fig. 6c supplémentaire). En plus d'obtenir des preuves directes, nous avons effectué une expérience à flux arrêté avec bo3 UqO. Comme N4 a une absorbance autour de 400–450 nm, nous avons utilisé N62 pour cette expérience. N62 est un dérivé de T113 et un inhibiteur commun pour mtCcO et bo3 UqO. Tout d'abord, nous avons confirmé que l'effet inhibiteur de N62 sur bo3 UqO était également réduit par les mutants dans le canal de l'oxygène comme N4 (Fig. 6d supplémentaire). Une expérience à flux arrêté avec bo3 UqO a démontré que l'inhibiteur ralentissait également la liaison du CO dans bo3 UqO, comme il l'a fait sur mtCcO (Fig. 5g). Collectivement avec ces analyses multimodales, nous concluons que nos inhibiteurs de HCO obstruent de manière allostérique l'entrée d'oxygène/NO moléculaire dans le BNC par un changement conformationnel d'une hélice transmembranaire de la sous-unité I, inhibant ainsi la fonction HCO.

Les médicaments dotés d'un mode d'action unique sont essentiels pour élargir nos options antimicrobiennes pour surmonter la résistance aux antimicrobiens, en particulier dans les cas où les agents pathogènes, y compris N. gonorrhoeae, ont acquis une résistance à tous les antibiotiques actuellement disponibles, se propagent à l'échelle mondiale et deviendraient incurables40. La chaîne respiratoire a été une cible potentielle pour le développement d'antibiotiques ; les inhibiteurs allostériques sont plus souhaitables que les orthostatiques pour minimiser le risque d'effets secondaires, compte tenu de l'importance de la chaîne respiratoire dans la vie. Ici, nous avons identifié une allostérie conservée dans les HCO et une hélice supplémentaire que l'on ne trouve que dans le mtCcO eucaryote. Cette différence structurelle dans l'allosterie nous a permis d'isoler les inhibiteurs spécifiques de deux HCO bactériens différents, dont un antibiotique contre un N. gonorrhoeae résistant à la ceftriaxone, qui est l'une des cinq menaces urgentes dans le rapport 2019 des Centers for Disease Control and Prevention3 .

Cette étude est une preuve de concept, et le composé en est encore au stade précoce du développement du médicament ; cependant, nos découvertes ouvriront la voie au développement d'antibiotiques avec un mécanisme d'action différent. La comparaison des structures publiées des HCO a révélé que la conformation stérique autour de l'hème à faible spin est très bien conservée dans tous les HCO de bactéries, levures, plantes et mammifères (Fig. 3 supplémentaire)41, suggérant que le site allostérique identifié par nous est susceptible d'être conservé. Par conséquent, notre approche peut générer des inhibiteurs spécifiques, des antibiotiques potentiels, pour chaque HCO bactérien à la demande avec une gamme étroite de spécificité. Le développement d'agents à spectre étroit est conforme à l'exigence actuelle de minimiser l'effet sur le microbiome de l'hôte et de prévenir une résistance généralisée42. Cibler les HCO peut ne pas être simple, car les bactéries pathogènes ont souvent plusieurs oxydases terminales dans leur chaîne respiratoire. Par conséquent, un inhibiteur de HCO souhaitable en tant qu'antibiotique est celui qui cible spécifiquement un stade infectieux particulier où les agents pathogènes ont un besoin critique de l'HCO pour s'adapter à l'environnement de croissance43, comme nous l'avons montré qNOR comme cible thérapeutique pour N. gonorrhoeae dans cette étude, ou peut être utilisé avec d'autres antibiotiques en association. Nos résultats suggèrent que les effets de l'inhibiteur d'UqO sur E. coli et de l'inhibiteur de qNOR sur N. gonorrhoeae étaient tous deux bactériostatiques. Bien que l'action bactéricide semble préférable, la supériorité de l'action bactéricide sur l'action bactériostatique a rarement été documentée44. D'autres recherches et développements sur les inhibiteurs de HCO sont nécessaires pour atteindre le domaine clinique.

L'une des quatre hélices de mtCcO entourant la poche allostérique est la sous-unité codée par le génome COX7C, recouvrant la surface comme si elle cachait le site allostérique. Notre analyse phylogénique a indiqué que le site allostérique des anciens HCO a été exposé et qu'il a été scellé dans des HCO mitochondriaux eucaryotes au cours de l'évolution moléculaire (Fig. 7 supplémentaire). La sous-unité spécifique eucaryote pourrait protéger mtCcO de l'accès aux inhibiteurs, ou il pourrait y avoir un inhibiteur endogène qui régule négativement l'activité de mtCcO à un moment précis. Le rôle évolutif de la sous-unité acquise nécessite des recherches supplémentaires.

Combinés à des expériences à flux arrêté, à la spectroscopie Raman par résonance et à l'analyse de mutants, nous avons conclu que nos inhibiteurs de HCO obstruent de manière allostérique l'entrée d'oxygène/NO moléculaire dans le BNC par un changement conformationnel d'une hélice transmembranaire de la sous-unité I, inhibant ainsi la fonction HCO. Cependant, notamment dans le cas de bo3 UqO, le site de liaison de N4 est le site de liaison des quinols. La structure quinone-bo3 UqO confirme que N4 occupe l'espace où le substrat se lie45. Asp75 et Arg71 sont les mêmes acides aminés N4 utilisés pour l'interaction moléculaire que la quinone45, suggérant que N4 inhibe bo3 UqO en obstruant la liaison au substrat. Ces résultats suggèrent que l'espace entouré par TM0 et TM1–3 de bo3 UqO fonctionne à la fois comme un site de liaison au substrat et comme un site d'inhibition allostérique que nous avons proposé. TM0 n'est présent que dans les quinol oxydases, dont bo3 UqO. Il stabilise efficacement l'ubiquinol hydrophobe dans la région transmembranaire afin que bo3 UqO puisse être utilisé comme substrat ; l'existence de TM0 rend la famille des ubiquinol oxydase unique. TM0 ne se trouve pas dans d'autres types de HCO, dans lesquels le site allostérique que nous avons proposé est distinct du site de liaison au substrat, comme le montre qNOR qui n'a pas de TM0.

En ce qui concerne mtCcO, nous avons démontré que le mécanisme inhibiteur de l'entrée d'oxygène joue un rôle important dans l'inhibition de T113 et N62 pour mtCcO ; cependant, d'autres mécanismes inhibiteurs pourraient également être impliqués, comme dans le cas que nous avons discuté pour N4 sur bo3 UqO. Nous avons trouvé le changement structurel dans Asp50/51 et Ser382 dans la structure cristalline de mtCcO-T113. Nous avons estimé qu'il était causé par la photoréduction lors de la préparation de l'échantillon et la réduction induite par le rayonnement pour les raisons suivantes. (1) le changement dans Asp50/51 et Ser382 se trouve dans la forme réduite de la structure CcO ; cependant, la simple addition de T113 n'a pas provoqué la réduction de CcO (Fig. 6a, b supplémentaires). (2) l'irradiation laser pendant l'acquisition de données Raman a provoqué une réduction de CcO. La figure 5e suggère que l'inhibiteur de mtCcO a abaissé le seuil de photoréduction. (3) La simulation MD avec l'inhibiteur n'a pas provoqué de changement structurel dans Asp50/51 (Fig. 6e supplémentaire). Ces observations, cependant, n'ont pas éliminé la possibilité que la liaison de T113 induise le changement structurel trouvé dans Asp50/51 et Ser382. La modification de ces résidus pourrait affecter le pompage de protons ou le transfert d'électrons ; Asp50/51 et Ser382 sont des résidus essentiels pour le pompage de protons, en particulier dans mtCcO, formant le canal H comme suggéré par Yoshikawa et al.16, bien que le canal H ne se trouve que dans mtCcO. Rich et ses collègues ont indiqué que le canal H fonctionne comme un puits diélectrique17. De plus, le groupe Sharma a récemment rapporté que le changement conformationnel dans le domaine porteur de Ser382 affecte le transfert d'électrons46. Ainsi, une perturbation dans la région peut provoquer une inhibition du pompage de protons ou du transfert d'électrons. Une étude plus approfondie est justifiée.

Notre simulation MD de 100 ns nous a donné un indice important sur le mécanisme allostérique de l'inhibiteur de mtCcO ; cependant, Re-apo MD n'a pas montré que le canal d'oxygène détend l'apo. Un MD plus long peut être nécessaire pour clarifier les détails du mécanisme moléculaire.

Notre approche peut être appliquée à la recherche de modulateurs allostériques dans d'autres cibles thérapeutiques. Les enzymes acquièrent généralement des domaines ou sous-unités supplémentaires au cours de l'évolution moléculaire22,23. Comme la chaîne respiratoire en bioénergétique est fondamentale et essentielle à la vie, les enzymes respiratoires autres que les HCO sont également conservées entre les espèces, ainsi que leurs structures centrales. La taille de la molécule de ces enzymes respiratoires est plus grande chez les eucaryotes que chez leurs homologues bactériens. Ils pourraient probablement contenir une allostérie à l'intérieur de la protéine à la limite des structures entre les eucaryotes et les bactéries, conduisant au développement d'antibiotiques, car la chaîne respiratoire est une cible éprouvée pour les antibiotiques. De plus, toute molécule fondamentale essentielle à la vie et conservée entre les espèces pourrait être une cible potentielle. En outre, les peptides supplémentaires pourraient contenir un site allostérique positif à la frontière de leur structure centrale ; un modulateur allostérique positif pour la maladie humaine de perte de fonction pourrait être une direction thérapeutique.

Généralement, la recherche d'un site allostérique est difficile, nécessitant un travail expérimental considérable pour chaque protéine cible et difficile à appliquer aux autres. Le concept d'allosterie conservée enfouie aidera à développer une approche systématique, ce qui a été vivement souhaité. Le nombre de structures protéiques a été considérablement augmenté par l'émergence de la cryo-EM et les avancées récentes dans la prédiction structurelle telles que Alphafold2 et RoseTTAfold47,48. La comparaison des structures protéiques entre les espèces, non seulement des structures statiques mais aussi des ensembles générés par MD, accélérera la recherche de sites allostériques conservés enfouis. Ainsi, en conclusion, cette étude ouvrira de nouvelles voies dans la science des protéines et le développement thérapeutique, en particulier pour les antibiotiques aux mécanismes d'action différents.

La solution et les cristaux de cytochrome c oxydase cardiaque bovine ont été préparés comme décrit dans une étude précédente49. Avant congélation, les cristaux ont été traités avec 2 mM de composé ou de DMSO dans le milieu final.

Des expériences de rayons X ont été réalisées sur les lignes de lumière SPring-8 BL26B1/B2. Le traitement et la mise à l'échelle des données de diffraction ont été effectués à l'aide de XDS50. La phase initiale a été calculée par MOLREP51 en utilisant un modèle de code PDB 5B1A après élimination des molécules non protéiques. Pour améliorer la densité et supprimer le biais du modèle, la méthode d'entropie maximale dans Phenix52 a été réalisée. Pour le calcul de la carte de densité électronique différentielle entre avec et sans composé, le calcul de la carte Fo – Fo dans CNS53 a été utilisé avec un modèle à ligand omis. La reconstruction a été effectuée à l'aide de COOT54. Les modèles ont été affinés avec REFMAC555 et phenix.refine56 avec les paramètres atomiques révisés par le Dr Tomitake Tsukihara. Pour supprimer le biais du modèle, toutes les cartes de densité électronique utilisées dans la reconstruction ont été calculées avec le modèle composé omis. Les cartes de densité électronique ont été confirmées avec des échantillons répétés. Les statistiques de raffinement sont fournies dans le tableau S1.

Le mtCcO purifié et les composés ont été incubés sur des plaques à 96 puits à 30 ° C pendant 30 min dans un tampon de dosage (pH 7, 4 phosphate de potassium 50 mM, 0, 1% d'albumine de sérum bovin, 0, 025% 14: 0 Lyso PG). Pour démarrer la réaction enzymatique, du cytochrome c réduit (1,5 uM) a été ajouté au mélange, puis les plaques ont été lues à 550 nm à l'aide d'un lecteur de plaques. La pente pendant 60 s a été calculée et la variation de l'activité mtCcO a été exportée en la comparant à l'échantillon traité au DMSO comme témoin négatif.

Les solutions de mtCcO pour la spectroscopie ont été préparées à 15 µM de mtCcO avec et sans 50 µM de N62 dans un tampon de phosphate de sodium 60 mM et 0,2 % de n-décyl-β-d-maltoside (pH 6,8) et leurs spectres ont été mesurés à 4 °C sauf indication contraire. . Les spectres d'absorption ont été mesurés dans une cuvette à trajet de 3 mm avec un spectrophotomètre (lamda650, PerkinElmer). Les spectres ont été présentés avec des valeurs d'absorbance équivalentes à 1 cm. Le mtCcO oxydé a été mesuré sous air et le mtCcO réduit en dithionite a été mesuré sous N2. Les spectres Raman de résonance ont été mesurés dans une cellule tournante à 2000 tr/min avec la longueur d'onde d'excitation à 441,6 nm (un laser HeCd, Kimmons). La lumière diffusée Raman a été détectée par un spectromètre Raman (500M, SPEX) relié à un CCD (Symphony II, Horiba) avec une géométrie de diffusion à 90°. Une solution de mtCcO oxydée au repos pour les mesures Raman a été préparée et transférée dans la cellule de filature scellée avec un septum en caoutchouc dans une boîte à gants (MM3-H60S, MIWA) à un niveau d'oxygène inférieur à 100 ppm. Le tampon utilisé et le septum en caoutchouc ont été dégazés et incubés dans la boîte à gants pendant une nuit. La solution d'échantillon ainsi préparée ne contenait qu'une petite quantité d'oxygène résiduel, ce qui garantissait l'observation d'une fraction d'hème a3 réduite à cinq coordonnées dans la mesure de photoréduction, tout en évitant une oxydation complète immédiate de tout l'hème a3.

Le système modèle a été construit à partir de la structure cristalline mtCcO bovine réduite (code d'identification PDB 3AG2) pour effectuer des simulations MD de tous les atomes. Toutes les molécules d'eau cristalline présentes dans la structure atomique du code d'identification PDB 3AG2 ont été supprimées. Les atomes d'hydrogène manquants des systèmes ont été ajoutés avec le programme tleap dans AmberTools 2020 (réf : https://ambermd.org/CiteAmber.php). Le champ de force Amber ff14SB pour les protéines, l'eau et les ions57 et le champ de force Amber lipid14 pour les lipides58 ont été adoptés dans les simulations MD. L'ensemble du mtCcO monomère à 13 sous-unités a été immergé dans une bicouche lipidique formée de 50% de phosphatidylcholine et de 50% de phosphatidyléthanolamine à l'aide de CHARMM-GUI59. La protéine avec des bicouches lipidiques a ensuite été solvatée avec le modèle d'eau TIP3P dans des boîtes rectangulaires. Les boîtes ont été préparées avec des marges de 20 Å en dehors de chaque protéine pour éviter les effets artificiels par ses images répétées périodiquement. Les paramètres pour les centres métalliques et les acides aminés ont été obtenus à partir d'une étude antérieure60. En bref, CuA et l'hème a ont été oxydés et l'hème a3 et CuB ont été réduits. Les états de protonation des résidus ont été déterminés par la méthode du continuum électrostatique. Les états de protonation des résidus importants sont les suivants : tous les propiones des hèmes a et a3 ont été déprotonés, Arg438 et 439 ont été déprotonés, Asp364 et Glu242 ont été déprotonés, His290 et His291 ont été protonés en position δ. Pour neutraliser chaque système avec des contre-ions, certaines molécules d'eau ont été sélectionnées au hasard et remplacées par un ensemble d'ions Na+ ou Cl−. La méthode d'Ewald à mailles de particules (PME) a ​​été utilisée pour les interactions de Coulomb61. Toutes les simulations MD ont été réalisées à l'aide du logiciel GROMACS 201962. L'ensemble du système membrane-protéine-solvant était composé de 302 004 atomes pour l'apo-MD et de 302 029 atomes pour l'holo-MD. Les simulations MD ont été réalisées sous un ensemble NPT constant (300 K et 1 atm) en utilisant un pas de temps de 2 fs.

Les traitements suivants (a à c) ont été considérés pour équilibrer chaque système : (a) La minimisation de l'énergie a été effectuée pour 10 000 étapes. (b) Un équilibrage MD de 100 ps a été effectué avec le thermostat V-rescale63 à 300 K sous 1 atm, et (c) un équilibrage MD de 100 ps a été effectué avec le couplage Berendsen64 à 300 K sous 1 atm. Chaque instantané a été enregistré toutes les 1 ps65. Enfin, une simulation MD de 100 ns a été réalisée sous un ensemble NPT constant (300 K et 1 atm) lors des cycles de production et les 80 dernières ns ont été utilisées comme analyses. Pour obtenir des trajectoires statistiquement fiables, nous avons effectué trois exécutions avec des vitesses initiales différentes pour les apo ou holo-structures.

Pour le premier groupe, nous avons calculé le coefficient de Tanimoto entre quatre inhibiteurs de mtCcO et chacun des 80 millions de composés disponibles dans le commerce sur la base d'empreintes digitales 2D (clés MACCS, ECFP4, FCFP4 et GpiDAPH3) et de métriques de forme 3D (ComboScore) avec le logiciel Pipeline Pilot (BIOVIA, Dassault Systèmes), MOE (Chemical Computing Group) et ROCS (OpenEye Scientific Software). Les composés présentant des valeurs de coefficient de Tanimoto élevées ont été regroupés par empreinte ECFP4, puis les composés au centre de chaque groupe ont été sélectionnés pour le dosage enzymatique. Pour le deuxième groupe, la structure complexe mtCcO/T113 a été préparée de manière appropriée à l'aide d'un assistant de préparation dans la suite Schrödinger 2016-1 (Schrödinger, LLC), puis une génération de grille de récepteur a été effectuée pour le protocole d'amarrage. 80 millions de composés disponibles dans le commerce ont été soumis à un docking moléculaire contre mtCcO à l'aide de Glide 7.0. Les composés sélectionnés sur la base du score Glide, qui partage le même espace que T113 dans le complexe, ont été regroupés par empreinte ECFP4, puis les composés au centre de chaque groupe ont été sélectionnés pour le dosage enzymatique. Enfin, 434 composés ont été sélectionnés et achetés.

Le plasmide codant pour bo3 UqO avec une étiquette His à l'extrémité carboxyle sur la sous-unité II était un cadeau du laboratoire Gennis66. bo3 UqO a été purifié sur la base de la méthode décrite précédemment67. En bref, le plasmide a été transformé dans la souche C43 (DE3) Δcyo E. coli, et les cellules ont été cultivées dans un milieu M63. bo3 UqO a été solubilisé par 1% de n-dodécyl-β-d-maltoside (C12M) et purifié avec de la résine TALON, de la résine Super-Q et une chromatographie d'exclusion de taille, puis stocké dans un tampon contenant du Tris-HCl 25 mM, 200 NaCl mM et 0,02 % de C12M (pH 7,5) à une concentration de 10 à 15 mg/mL.

L'E. coli bo3 UqO purifié a été reconstitué dans des liposomes (phosphatidylcholine de jaune d'oeuf : lipide polaire d'E. coli = 3:1). Des souris BALB/c femelles ont été immunisées cinq fois avec des doses de 0,1 mg de bo3 UqO reconstituée avec 50 µg de lipopolysaccharide, à des intervalles de 7 jours. Des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de la rate des souris immunisées et les cellules ont été fusionnées avec des cellules de myélome P3U1, en utilisant la méthode conventionnelle au polyéthylène glycol (PEG)68. Le dépistage des anticorps a été effectué par trois méthodes, le test immuno-enzymatique liposome (L-ELISA), l'ELISA dénaturé (D-ELISA) et la chromatographie d'exclusion stérique (SEC)69. Pour L-ELISA, la bo3 UqO purifiée a été reconstituée dans des liposomes contenant du biotinyl-PE et a été immobilisée sur des plaques Immobilizer Streptavidin (Nunc). Les anticorps de haute affinité qui formaient des complexes stables avec la bo3 UqO purifiée ont été sélectionnés par SEC sur une colonne Superdex 200 5/150 (GE Healthcare). Les anticorps qui reconnaissaient la conformation native de E. coli bo3 UqO ont été dosés par D-ELISA avec E. coli bo3 UqO dénaturé au SDS. Trois clones sélectionnés ont été isolés par la méthode de culture par dilution limitante, et des lignées cellulaires d'hybridomes monoclonaux produisant des anticorps anti-bo3 UqO ont été établies. Le fragment Fab d'un anticorps monoclonal anti-bo3 UqO a été préparé comme décrit69. Les protéines bo3 UqO purifiées ont été mélangées avec le fragment Fab pendant 24 h à 4 ° C, et les complexes bo3 UqO – Fab ont été purifiés par SEC, suivis d'une incubation avec N4. Nous avons testé trois clones par cryo-EM et sélectionné celui pour la détermination structurale.

L'UqO purifiée et les composés ont été incubés sur des plaques à 96 puits à 25 ° C pendant 60 min dans un tampon de dosage (pH 7,4, phosphate de potassium 50 mM, acide éthylènediamine-N', N', N', N'-tétraacétique (EDTA ), 0,1 % d'albumine de sérum bovin, 0,15 % de C12M). Pour démarrer la réaction enzymatique, une quantité réduite de 40 uM d'UQ-1 a été ajoutée au mélange, puis les plaques ont été lues à 278 nm à l'aide d'un lecteur de plaques. La pente a été calculée et le changement d'activité enzymatique a été exporté en le comparant à l'échantillon traité au DMSO comme témoin négatif.

Un échantillon de 3 µL a été appliqué sur une grille Quantifoil à décharge luminescente (R1.2/R1.3 300 mesh, cuivre), buvardé dans une humidité de 100 % à 8 °C et plongé dans de l'éthane liquide à l'aide de Vitrobot MkIV. L'analyse Cryo-EM a été initialement réalisée en utilisant un microscope Talos Arctica à 200 kV avec un détecteur Falcon3 au KEK. La collecte de données a été effectuée à l'aide d'un microscope Glacios avec un détecteur Gatan K2 Summit en mode comptage au RIKEN SPring-8. Les films ont été acquis à un grossissement ×45 000 avec une dose cumulée de 50,0 électrons par Å2 sur 40 images. La taille de pixel était de 0,889 Å. Les données ont été acquises automatiquement par la méthode de décalage faisceau-image à l'aide du logiciel SerialEM70.

Le traitement des données Cryo-EM a été effectué à l'aide de RELION 3.171. Les piles de films bruts ont été corrigées en mouvement à l'aide de MotionCor272 de la propre implémentation de RELION. Les paramètres CTF ont été déterminés à l'aide du programme CTFFIND473. Les flux de travail de traitement des données pour UqO (12 388 piles de films de Glacios) et le complexe UqO / composé (7 173 piles de films de Glacios) sont résumés dans la Fig. S3A – H, respectivement. La résolution finale a été estimée par la corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence entre les deux demi-cartes raffinées indépendamment (FSC = 0,143). Pour la construction de modèles par rapport à la carte EM, un modèle initial a été généré par modélisation d'homologie avec la suite de programmes MOE (MOLSIS Inc.) et ancré dans la carte finale à l'aide de Chimera74. Le modèle a ensuite été affiné manuellement à l'aide du programme COOT54. Le raffinement de l'espace réel dans le programme Phenix a été effectué avec les paramètres atomiques des hèmes révisés à partir de la valeur par défaut52. Un résumé des paramètres du modèle et les statistiques de la carte cryo-EM sont fournis dans le tableau S2.

E. coli a été cultivé pendant une nuit dans du milieu LB et dilué à OD600 de 0,0132. 5 µL de cellules ont été ajoutés à chaque puits de la plaque à 96 puits et traités par un composé à des concentrations de 128 µg/mL ou des dilutions en série doubles dans 100 µL de milieu LB. Les plaques ont ensuite été incubées à 37 ° C pendant 24 h sans agitation et lues à 600 nm à l'aide d'un lecteur de plaques pour quantifier la croissance cellulaire. La coloration C43 (DE3) et C43 (DE3) Δcyo ont été fournies par le Dr Yoshio Nakatani et utilisées respectivement comme souche de type sauvage et souche bo3 UqO-knockout. C43 (DE3) ΔcydΔappx a été fourni par le Dr Robert Gennis et utilisé pour la souche bo3 UqO-dépendante. Comme N4 à 32 µg/ml a démontré une inhibition de la croissance à partir de l'essai ci-dessus, nous avons effectué un essai de viabilité dépendant du temps et de la concentration à 32, 128 µg/ml de N4. Un inoculum a été constitué d'environ 1 × 105 UFC/ml puis incubé à 37 °C sans agitation. Les colonies survivantes ont été comptées à des temps fixes (12, 24, 48 et 72 h).

Neisseria meningitidis bb3 qNOR a été fourni par le laboratoire Shiro. L'expression et la purification ont été effectuées comme indiqué précédemment avec modification34.

La souche de référence N. gonorrhoeae WHO F75 et une FC42876 résistante à la ceftriaxone ont été utilisées pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens. N. gonorrhoeae a été cultivé dans un milieu GW sous 5 % de CO2 à 37 °C sans agitation77. Nous avons sous-traité la préparation du milieu à l'Institut de recherche pour les peptides fonctionnels Co., Ltd. La méthode MIC de dilution en micro-bouillon a été utilisée pour mesurer quantitativement l'activité antibactérienne in vitro de Q275 contre les souches bactériennes. La plus faible concentration d'antibiotique qui a empêché la croissance a été interprétée comme la CMI. Du nitrite de sodium (20 mM) a été ajouté au milieu pour imiter une condition de défi NO (attaque des cellules immunitaires). Pour le test de comptage des colonies, nous avons préparé un inoculum d'environ 5 × 105 UFC/ml, puis l'avons incubé à 37 ° C pendant 24 h sans agitation. Les colonies survivantes ont été comptées.

Des mutants de Neisseria gonorrhoeae ont été construits comme décrit précédemment78. Brièvement, afin de construire le mutant déficient en norB de N. gonorrhoeae, un fragment d'ADN de 4,3 kb de l'ADN chromosomique FA1090 de N. gonorrhoeae contenant le gène norB a été amplifié avec les amorces norB-1 et norB-2 par l'ADN polymérase PrimeSTAR Max ( Takara Bio) et cloné dans le site Smal du vecteur pMW119 (4,2 kb) (gène Nippon) pour construire pHT1729 (8,5 kb). La région d'ADN de 6,5 kb de pHT1729 a été amplifiée avec les amorces norB-3 et norB-4 par l'ADN polymérase PrimeSTAR Max et a été ligaturée avec un gène de résistance à la kanamycine (kan) pour construire pHT1739. Un fragment d'ADN de 3 kb contenant l'allèle norB, dans lequel le gène de structure norB a été remplacé par le gène kan, a été amplifié avec les amorces norB-1 et norB-2 de pHT1739, et transformé dans des souches de N. gonorrhoeae et des clones résistants à la kanamycine ont été sélectionnés, résultant en des mutants déficients en norB. Les amorces utilisées sont,

norB-1TCGAGCTCGGTACCCGATGTAGAACTCTTATCCACTTTCGGCAG

norB-2CTCTAGAGGATCCCCAGGCGGGGCAGCCGCCGTTTCCAACGGTTTG

norB-3GGGAAAACCCTGGCGGTTTTAGCCTGAAAAATGGAAACCG

norB-4CATAGCTTGTTTCCTGTTTGAGAGCTCCTTTTAATAAATC

Pour préparer l'enzyme entièrement réduite, une solution enzymatique (1 µM de mtCcO ou 0,5 µM bo3 UqO), mélangée avec du DMSO ou 200 µM de N62, a été alternativement incubée sous vide et sous atmosphère de N2, puis réduite par du dithionite. Une solution de CO a été préparée en incubant alternativement sous vide et une atmosphère de 20 % de CO pour mtCcO ou 100 % de CO pour bo3 UqO. Pour étudier la liaison du CO à l'enzyme réduite, un volume égal de la solution d'enzyme réduite et de la solution de CO ont été mélangés dans un spectromètre à flux arrêté à 4 ° C.

Un analyseur de flux extracellulaire XFe96 (Agilent) a été utilisé pour mesurer le taux de consommation d'oxygène (OCR). Des cellules C2C12 de souris ont été ensemencées dans une microplaque de culture XFe96 (1,0 × 104 cellules par puits) un jour avant la mesure. L'OCR de chaque puits a été mesuré dans du DMEM non tamponné contenant 2 mM de l-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium dans des conditions basales et en réponse à 1 µM d'oligomycine A (Oligo A), 2 µM de cyanure de fluorocarbonyle phénylhydrazone (FCCP) et 0,5 µM roténone + antimycine A 0,5 µM (Anti/Rote). L'OCR pour la production d'ATP a été calculé comme OCR basal-Oligo A OCR à l'aide du générateur de rapport de test de stress Mito.

Un test de LDH sur microplaque (kit de test de cytotoxicité LDH, Dojindo, CK12) a été utilisé pour déterminer la cytotoxicité du Q275. Les cellules de mammifères utilisées étaient des cardiomyocytes néonatals de rat, cultivés dans du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits, à fond plat, traitée par culture tissulaire et incubées à 37 °C avec 5 % de CO2. Après 24 heures, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu frais contenant les composés à tester. Après 24 h d'incubation, l'activité LDH dans le surnageant a été évaluée selon les directives des fabricants.

Pour acquérir la séquence d'acides aminés de la base de données, la séquence dont la structure cristalline a été élucidée et enregistrée dans le PDB a été préférentiellement sélectionnée (PDB ID a été montré). Pour les autres séquences d'acides aminés, les séquences représentatives du taxon ont été sélectionnées parmi les enzymes HCO de types A, B, C et NOR selon le rapport précédent41. Ceux-ci indiquaient comme suit : Bos taurus (5B1A_1), Homo sapiens (5Z62_1), Saccharomyces cerevisiae (6T15_11), Pseudomonas stutzeri (3MK7_1), Rhodobacter capsulatus (6XKX_4), Thermus thermophilus (A2 : 2YEV_1, ba3 : 1EHK_1), Escherichia coli ( 1FFT_1), Bacillus subtilis (bo3 : 6KOB_1, aa3 : P24010), Mus musculus (BBA31677), Aquifex (A1 : O67935, A2 : O67937), Rhodothermus marinus (CAC08532), Paracoccus denitrificans (P08305), Yersinia pestis (WP042593520), Pseudomonas aeruginosa (MXH36788), Snodgrassella alvi (WP_100091491), bactérie Rickettsiales (MBB19300), Lacrimispora indolis (VDG67555), Halobacterium (WP_010902450), Natronomonas pharaonis (CAA71525), Geobacillus stearothermophilus (3 AYG) et Pseudomonas aeruginosa (3O0R).

L'alignement de plusieurs séquences d'acides aminés a été effectué à l'aide de Clustal Omega v1.2.1 après avoir coupé l'extrémité N-terminale pour aligner la longueur totale de l'alignement79. Un paramètre par défaut a été utilisé et la conservation des régions essentielles pour la voie du proton (canal du proton) dans les HCO, telles que les ligands métalliques et les résidus catalytiques de tyrosine, a été visuellement confirmée. Les arbres de jonction de voisins (NJ) ont été déduits avec l'algorithme BioNJ80 en utilisant PhyML v2016011581 avec les paramètres suivants : 1000 bootstraps, 100 graines et correction pour les substitutions multiples. Un arbre de consensus majoritaire a été créé et visualisé dans Dendroscope v3.7582.

Aucune statistique n'a été appliquée, à l'exception de l'analyse de SD pour la Fig. 5f, g. Les expériences ont été répétées au moins deux fois et ont confirmé sa reproductibilité.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les cartes cryo-EM ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) sous le code d'accession EMD-33293 (apo-bo3 UqO) et EMD-33294 (holo-bo3 UqO). Les coordonnées se trouvent dans la Protein Data Bank (PDB) sous le code d'accession 7XMA (apo-mtCcO), 7XMB (holo-mtCcO), 7XMC (apo-bo3 UqO), 7XMD (holo-bo3 UqO). Les codes d'accession précédemment publiés utilisés dans ce travail sont 5B1A a été utilisé pour le calcul de la phase initiale dans l'expérience de diffraction des rayons X. 3AG2 a été utilisé pour la simulation MD. Pour Fig. 7 supplémentaire, 5Z62, 5B1A, 6GIQ, 6KOB, 6WTI, 1QLE, 2YEV, 1EHK, 6XKW, 5DJQ, 3AYG, 3O0R. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 2B–E, 3E, 4B–I, 5B, D, F, G, S1A–C, S4A–D, S5D, H, J, S6A–D sont fournis sous forme de fichier de données source. Les données sources sont fournies dans ce document.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s41467-022-35600-y

Laxminarayan, R. et al. La résistance aux antibiotiques - le besoin de solutions globales. Lancette infectée. Dis. 13, 1057-1098 (2013).

Article Google Scholar

Unemo, M. et al. Surveillance mondiale de la résistance aux antimicrobiens de l'OMS pour Neisseria gonorrhoeae 2017-2018 : une étude observationnelle rétrospective. Lancet Microbe 5247, 3–5 (2021).

Google Scholar

Centres pour le Contrôle et la Prévention des catastrophes. Menaces de résistance aux antibiotiques aux États-Unis. Centres Dis. Contrôle Préc. 1–113 https://doi.org/10.15620/cdc:82532 (2019).

Unemo, M. et al. Programme mondial de surveillance antimicrobienne des gonocoques de l'Organisation mondiale de la Santé (WHO GASP) : examen des nouvelles données et preuves pour éclairer les actions de collaboration et les efforts de recherche internationaux. Sexe. Santé 16, 412 (2019).

Article Google Scholar

Bald, D., Villellas, C., Lu, P. & Koul, A. Cibler le métabolisme énergétique chez Mycobacterium tuberculosis, un nouveau paradigme dans la découverte de médicaments antimycobactériens. MBio 8, e00272—17-11 (2017).

Article Google Scholar

Cook, GM, Hards, K., Vilchèze, C., Hartman, T. & Berney, M. Énergétique de la respiration et de la phosphorylation oxydative chez les mycobactéries. Microbiol. Spectre. 2, 1–20 (2014).

Article CAS Google Scholar

Goodman, CD et al. Les parasites résistants à l'atovaquone antipaludique ne se transmettent pas par les moustiques. Sciences (80-.) 352, 349–353 (2016).

Article ADS CAS Google Scholar

Hasenoehrl, EJ, Wiggins, TJ & Berney, M. Inhibiteurs bioénergétiques : efficacité antibiotique et mécanismes d'action chez Mycobacterium tuberculosis. Devant. Cellule. Infecter. Microbiol. 10, 1–26 (2021).

Article Google Scholar

Duvenage, L., Munro, CA & Gourlay, CW Le potentiel de l'inhibition de la respiration comme nouvelle approche pour lutter contre les agents pathogènes fongiques humains. Courant. Genet. 65, 1347–1353 (2019).

Article CAS Google Scholar

Shiba, T. et al. Structure de l'oxydase alternative insensible au cyanure des trypanosomes. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 110, 4580–4585 (2013).

Article ADS CAS Google Scholar

Luo, M. et al. La bédaquiline inhibe les ATP synthases mitochondriales de la levure et de l'homme. Commun. Biol. 3, 1–10 (2020).

Article Google Scholar

Wenthur, CJ, Gentry, PR, Mathews, TP & Lindsley, CW Médicaments pour les sites allostériques sur les récepteurs. Annu. Rév. Pharmacol. Toxicol. 54, 165-184 (2014).

Article CAS Google Scholar

Nussinov, R. & Tsai, CJ Allostery dans la maladie et dans la découverte de médicaments. Cellule 153, 293–305 (2013).

Article CAS Google Scholar

Tsukihara, T. et al. L'ensemble de la structure de la 13 sous-unité oxydase cytochrome c oxydase à 2,8 Å. Science (80-.) 272, 1136–1144 (1996).

Article ADS CAS Google Scholar

Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B., Hartmut, B. et Michel, H. Structure à une résolution de 2,8 Å de la cytochrome c oxydase de Paracoccus denitrificans. Nature 376, 660–669 (1995).

Article ADS CAS Google Scholar

Yoshikawa, S. & Shimada, A. Mécanisme de réaction de la cytochrome c oxydase. Chim. Rév.115, 1936–1989 (2015).

Article CAS Google Scholar

Rich, PR Cytochrome c oxydase mitochondriale : catalyse, couplage et controverses. Biochimie. Soc. Trans. 45, 813–829 (2017).

Article CAS Google Scholar

Ishigami, I., Hikita, M., Egawa, T., Yeh, SR & Rousseau, DL Translocation de protons dans la cytochrome c oxydase : aperçu de la cinétique d'échange de protons et de la spectroscopie vibrationnelle. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 1847, 98-108 (2015).

Article CAS Google Scholar

Wikström, M., Krab, K. & Sharma, V. Activation de l'oxygène et conservation de l'énergie par la cytochrome c oxydase. Chim. Rév. 118, 2469–2490 (2018).

Article Google Scholar

Sagan, L. Sur l'origine des cellules en mitose. J. Théor. Biol. 14, 225–IN6 (1967).

Article ADS CAS Google Scholar

Wallace, DC Pourquoi avons-nous encore un ADN mitochondrial hérité de la mère ? Aperçus de la médecine évolutive. Annu. Rév. Biochem. 76, 781–821 (2007).

Article CAS Google Scholar

Werner, F. & Grohmann, D. Evolution des ARN polymérases multi-sous-unités dans les trois domaines de la vie. Nat. Rév. Microbiol. 9, 85–98 (2011).

Article CAS Google Scholar

Petrov, AS et al. Histoire du ribosome et origine de la traduction. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 112, 15396–15401 (2015).

Article ADS CAS Google Scholar

Hayashi, T. et al. Higd1a est un régulateur positif de la cytochrome c oxydase. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 112, 1553–1558 (2015).

Article ADS CAS Google Scholar

Nagao, T. et al. Higd1a améliore la fonction respiratoire dans les modèles de troubles mitochondriaux. FASEB J. 34, 1859–1871 (2020).

Article CAS Google Scholar

Okada-Iwabu, M. et al. Un agoniste AdipoR à petite molécule pour le diabète de type 2 et la courte durée de vie dans l'obésité. Nature 503, 493–499 (2013).

Article ADS CAS Google Scholar

Sato, T. et al. Application de la machine à vecteurs de support au criblage virtuel tridimensionnel basé sur la forme à l'aide d'une superposition complète de formes moléculaires tridimensionnelles avec des inhibiteurs connus. J. Chem. Inf. Modèle. 52, 1015-1026 (2012).

Article CAS Google Scholar

Borisov, VB, Gennis, RB, Hemp, J. & Verkhovsky, MI Le cytochrome bd oxygène réductases respiratoires. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 1807, 1398-1413 (2011).

Article CAS Google Scholar

Unemo, M. & Shafer, WM Résistance aux antimicrobiens chez Neisseria gonorrhoeae au 21e siècle : passé, évolution et avenir. Clin. Microbiol. Rév. 27, 587–613 (2014).

Article Google Scholar

Knapp, JS & Clark, VL Croissance anaérobie de Neisseria gonorrhoeae couplée à la réduction des nitrites. Infecter. Immun. 46, 176-181 (1984).

Article CAS Google Scholar

Falsetta, ML et al. Le profilage transcriptionnel identifie le phénotype métabolique des biofilms gonococciques. Infecter. Immun. 77, 3522–3532 (2009).

Article CAS Google Scholar

Stevanin, TMTM, Moir, JWBB & Read, RC Les systèmes de détoxification de l'oxyde nitrique améliorent la survie de Neisseria meningitidis dans les macrophages humains et dans la muqueuse nasopharyngée. Infecter. Immun. 73, 3322–3329 (2005).

Article CAS Google Scholar

Matsumoto, Y. et al. Structure cristalline de l'oxyde nitrique réductase quinol-dépendante de Geobacillus stearothermophilus. Nat. Structure. Mol. Biol. 19, 238-245 (2012).

Article CAS Google Scholar

Gonska, N. et al. Caractérisation de l'oxyde nitrique réductase quinol-dépendante du pathogène Neisseria meningitidis, une enzyme électrogénique. Sci. Rep. 8, 1–13 (2018).

Article ADS CAS Google Scholar

Yano, N. et al. Le groupe d'eau contenant du Mg2+ de la cytochrome c oxydase de mammifère recueille quatre équivalents de protons de pompage dans chaque cycle catalytique. J. Biol. Chim. 291, 23882–23894 (2016).

Article CAS Google Scholar

Motlagh, HN, Wrabl, JO, Li, J. & Hilser, VJ La nature d'ensemble de l'allostérie. Nature 508, 331–339 (2014).

Article ADS CAS Google Scholar

Ogura, T., Yoshikawa, S. & Kitagawa, T. Resonance Raman étude sur la photoréduction de la cytochrome c oxydase : distinction des cytochromes a et a3 dans les états d'oxydation intermédiaires. Biochimie 24, 7746–7752 (1985).

Article CAS Google Scholar

Kitagawa, T. & Orii, Y. Resonance Raman étudie la cytochrome oxydase. J. Biochem. 84, 1245-1252 (1978).

Article CAS Google Scholar

Salomonsson, L., Lee, A., Gennis, RB et Brzezinski, P. Un couvercle à un seul acide aminé rend un compartiment étanche aux gaz dans un transporteur lié à la membrane. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 101, 11617–11621 (2004).

Article ADS CAS Google Scholar

Unemo, M. et al. Blennorragie. Nat. Rév. Dis. Prisme. 5, 79 (2019).

Sousa, FL et al. La superfamille des réductases d'oxygène hème-cuivre: types et considérations évolutives. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 1817, 629-637 (2012).

Article CAS Google Scholar

Bax, R. & Green, S. Antibiotiques : le paradigme changeant de l'industrie réglementaire et pharmaceutique. J. Antimicrobe. Chimimère. 70, 1281-1284 (2014).

Article Google Scholar

Kakishima, K., Shiratsuchi, A., Taoka, A., Nakanishi, Y. & Fukumori, Y. Participation de l'oxyde nitrique réductase à la survie de Pseudomonas aeruginosa dans les macrophages activés par le LPS. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 355, 587–591 (2007).

Article CAS Google Scholar

Rhee, KY & Gardiner, DF Pertinence clinique de l'activité bactériostatique par rapport à l'activité bactéricide dans le traitement des infections bactériennes à Gram positif [2]. Clin. Infecter. Dis. 39, 755–756 (2004).

Article Google Scholar

Li, J. et al. Les structures Cryo-EM du cytochrome bo 3 d'Escherichia coli révèlent des phospholipides liés et de l'ubiquinone-8 dans un site de liaison au substrat dynamique. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 118, e2106750118 (2021).

Article CAS Google Scholar

Reidelbach, M., Zimmer, C., Meunier, B., Rich, PR & Sharma, V. Transfert d'électrons couplé à la dynamique conformationnelle dans la respiration cellulaire. Devant. Mol. Biosci. 8, 1–12 (2021).

Article Google Scholar

Tunyasuvunakool, K. et al. Prédiction très précise de la structure des protéines pour le protéome humain. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-021-03828-1 (2021).

Article Google Scholar

Baek, M. et al. Prédiction précise des structures et des interactions des protéines à l'aide d'un réseau de neurones à trois voies. Sciences (80-.) 8754, eabj8754 (2021).

Google Scholar

Shinzawa-Itoh, K. et al. La structure de résolution de 1,3 Å de la cytochrome c oxydase bovine suggère un mécanisme de dimérisation. BBA Adv. 1, 100009 (2021).

Article CAS Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 66, 125-132 (2010).

Article CAS Google Scholar

Vagin, A. & Teplyakov, A. MOLREP : un programme automatisé pour le remplacement moléculaire. J. Appl. Cristallologue. 30, 1022-1025 (1997).

Article CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX : un système complet basé sur Python pour la solution de structure macromoléculaire. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 66, 213–221 (2010).

Article CAS Google Scholar

Brunger, AT Version 1.2 du système de cristallographie et RMN. Nat. Protocole 2, 2728–2733 (2007).

Article CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot : outils de création de modèles pour les graphiques moléculaires. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 60, 2126-2132 (2004).

Article Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 pour le raffinement des structures cristallines macromoléculaires. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 67, 355–367 (2011).

Article CAS Google Scholar

Afonine, PV et al. Vers un raffinement de structure cristallographique automatisé avec phenix.refine. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 68, 352–367 (2012).

Article CAS Google Scholar

Maier, JA et al. ff14SB : amélioration de la précision des paramètres de la chaîne latérale et du squelette des protéines à partir de ff99SB. J. Chem. Calcul théorique. 11, 3696–3713 (2015).

Article CAS Google Scholar

Dickson, CJ et al. Lipid14 : le champ de force lipidique ambre. J. Chem. Calcul théorique. 10, 865–879 (2014).

Article CAS Google Scholar

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI : une interface utilisateur graphique basée sur le Web pour CHARMM. J. Comput. Chim. 29, 1859-1865 (2008).

Article CAS Google Scholar

Sato, W. et al. Mécanisme énergétique de la formation du complexe de transfert d'électrons cytochrome c – cytochrome c oxydase dans des conditions de renouvellement révélé par des effets mutationnels et une simulation d'amarrage. J. Biol. Chim. 291, 15320–15331 (2016).

Article CAS Google Scholar

Ewald, PP Le calcul des potentiels de réseau optique et électrostatique. ann. Phys. 369, 253-287 (1921).

Article MATH Google Scholar

Abraham, MJ et al. Gromacs : simulations moléculaires hautes performances grâce au parallélisme multi-niveaux des ordinateurs portables aux superordinateurs. LogicielX 1–2, 19–25 (2015).

Annonces d'article Google Scholar

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Échantillonnage canonique par remise à l'échelle de la vitesse. J. Chem. Phys. 126, (2007).

Berendsen, HJC, Postma, JPM, van Gunsteren, WF, DiNola, A. & Haak, JR Dynamique moléculaire avec couplage à un bain externe. J. Chem. Phys. 81, 3684–3690 (1984).

Article ADS CAS Google Scholar

Morita, R., Nakano, K., Shigeta, Y. & Harada, R. Mécanisme moléculaire du domaine de liaison à l'actine de l'α-actinine Ain1 élucidé par des simulations de dynamique moléculaire et des expériences de mutagenèse. J.Phys. Chim. B 124, 8495–8503 (2020).

Article CAS Google Scholar

Lai, LY, Samoilova, RI, Gennis, RB & Dikanov, SA Caractérisation des protons échangeables à proximité immédiate du radical semiquinone au site QH du cytochrome bo 3 d'Escherichia coli. J. Biol. Chim. 281, 16879–16887 (2006).

Article Google Scholar

Abramson, J. et al. Purification, cristallisation et études cristallographiques préliminaires d'une protéine membranaire intégrale, la cytochrome bo 3 ubiquinol oxydase d'Escherichia coli. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 56, 1076-1078 (2000).

Article CAS Google Scholar

Köhler, G. & Milstein, C. Cultures continues de cellules fusionnées sécrétant des anticorps de spécificité prédéfinie. Nature 256, 495–497 (1975).

Annonces d'article Google Scholar

Tanabe, H. et al. Expression, purification, cristallisation et études cristallographiques préliminaires aux rayons X des récepteurs humains de l'adiponectine, AdipoR1 et AdipoR2. J. Structure. Fonct. Génome. 16, 11–23 (2015).

Article CAS Google Scholar

Mastronarde, DN SerialEM : un programme pour l'acquisition automatisée de séries d'inclinaison sur les microscopes Tecnai utilisant la prédiction de la position de l'échantillon. Microsc. Microanal. 9, 1182-1183 (2003).

Annonces d'article Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nouveaux outils pour la détermination automatisée de la structure cryo-EM à haute résolution dans RELION-3. Elife 7, 1–22 (2018).

Article Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2 : correction anisotrope du mouvement induit par le faisceau pour une cryomicroscopie électronique améliorée. Nat. Méthodes 14, 331–332 (2017).

Article CAS Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4 : estimation rapide et précise de la défocalisation à partir de micrographies électroniques. J. Structure. Biol. 192, 216-221 (2015).

Article Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera - un système de visualisation pour la recherche exploratoire et l'analyse. J. Comput. Chim. 25, 1605-1612 (2004).

Article CAS Google Scholar

Unemo, M. et al. Les nouvelles souches de référence de Neisseria gonorrhoeae 2016 de l'OMS pour l'assurance qualité mondiale des investigations de laboratoire : caractérisation phénotypique, génétique et du génome de référence. J. Antimicrobe. Chimimère. 71, 3096–3108 (2016).

Article CAS Google Scholar

Nakayama, SI et al. Nouvelle souche de Neisseria gonorrhoeae multirésistante à la ceftriaxone et aux médicaments avec un nouveau gène mosaïque penA isolé au Japon. Antimicrobien. Agents Chemother. 60, 4339–4341 (2016).

Article CAS Google Scholar

Wade, JJ & Graver, MA Un milieu liquide entièrement défini, clair et sans protéines permettant une croissance dense de Neisseria gonorrhoeae à partir d'inoculums très faibles. Microbiol FEMS. Lett. 273, 35-37 (2007).

Article CAS Google Scholar

Takahashi, H. & Watanabe, H. Un homologue gonococcique du gène méningococcique γ-glutamyl transpeptidase est un nouveau type de pseudogène bactérien qui est transcriptionnellement actif mais phénotypiquement silencieux. BMC Microbiol. 5, 1–13 (2005).

Article Google Scholar

Sievers, F. & Higgins, DG Le package d'alignement multiple clustal omega. Méthodes Mol. Biol. 2231, 3–16 (2021).

Article CAS Google Scholar

Gascuel, O. BIONJ : une version améliorée de l'algorithme NJ basée sur un modèle simple de données de séquence. Mol. Biol. Évol. 14, 685–695 (1997).

Article CAS Google Scholar

Guindon, S. et al. Nouveaux algorithmes et méthodes pour estimer les phylogénies à vraisemblance maximale : évaluer les performances de PhyML 3.0. Syst. Biol. 59, 307–321 (2010).

Article CAS Google Scholar

Huson, DH et al. Dendroscope : un visualiseur interactif pour les grands arbres phylogénétiques. BMC Bioinform. 8, 1–6 (2007).

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Tout d'abord, tous les auteurs remercient vivement le Dr Tomitake Tsukihara et le Dr Shinya Yoshikawa pour leurs conseils avisés et leurs discussions sur le projet. Nous remercions vivement Mme Akiko Ogai pour son aide dans la préparation des protéines ; Mme Satomi Kobayashi, Mme Kanami Inagaki, Mme Keiko Shingu et Mme Satomi Gion pour l'assistance en laboratoire ; Mme Yuko Okada, Mme Hisae Kawasaki et Mme Yukako Kurokawa pour le secrétariat ; Dr Yuki Nakamura pour son aide dans l'acquisition de données dans SPring-8 BL26 ; Dr Hiroshi Aoyama pour son aide dans la préparation du cristal pour l'expérience aux rayons X ; Dr Takeshi Yokoyama, Dr Tomomi Uchikubo, Dr Mikako Shirouzu pour la direction de l'analyse de particules uniques cryo-EM ; Dr Naruhiko Adachi et Dr Masato Kawasaki pour le dépistage initial pour l'acquisition de données cryo-EM de la préparation d'oxydase E. coli bo3 (sous BINDS 1721); le Dr Robert Gennis et le Dr Sangjin Hong pour avoir fourni les souches d'E. coli et la construction de la bo3 oxydase d'E. coli ; le Dr Yoshio Nakatani pour avoir fourni des souches d'E. coli ; Dr Ken Daniel Inaoka et Dr Kiyoshi Kita pour avoir fourni des souches d'E. coli et des conseils sur la préparation de la protéine bo3 ; Dr Vivek Sharma pour son aide sur la préparation de la simulation MD ; Dr. Hiroshi Sugimoto pour ses conseils sur l'analyse structurelle bo3 ; Dr Naoki Mochizuki, Dr Kazu Kikuchi et Dr Hajime Fukui pour les commentaires sur le manuscrit, Dr James Pearson pour la révision en anglais ; Mme C. Shintani pour ses conseils sur la préparation de la silhouette. Cette recherche a été soutenue par Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) sous Grant Numbers, JP19am0101113, JP21am0101070, JP20am0101071 , JP21am0101082, JP20am0101109, JP20am0101083 (numéros d'assistance 1096, 1099, 1721, 2161, 2310 et 2357). Les expériences de rayonnement synchrotron ont été réalisées au SPring-8 avec l'approbation du Japan Synchrotron Radiation Research Institute (JASRI) (Proposition n° 2016A2529, 2016B2711, 2017A2555 et 2017B2721, 2018A2721, 2021B2523, 2022A2713). Ce travail a été soutenu par un financement de la Japan Science and Technology Agency-Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST) ​​sous Grant Number, JPMJCR14M2 à ST AMED sous Grant Number, JP19im0210617, JP21ek0109499 et JP22fk0108632 à YShintani. JP21fk0108605 à MO Grants-in-Aid for Scientific Research de la Japan Society for the Promotion of Science under Grant Numbers, 21H02914 à ST, 21K15443 à YN, 19H05784 à MK et 20K03794 à KK Grants-in-Aid for Innovative research "Biometal Sciences" sous le numéro de subvention 20H05497 à Y.Shigeta.

Hideki Shigematsu

Adresse actuelle : Division de la biologie structurale, Institut japonais de recherche sur le rayonnement synchrotron, SPring-8 ; Sayo, Hyōgo, Japon

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sachiko Yanagisawa, Rikuri Morita.

Département de pharmacologie moléculaire, Centre national cérébral et cardiovasculaire, Suita, Osaka, Japon

Yuya Nishida, Chisa Nakabayashi, Takemasa Nagao, Tasneem Qaqorh, Yusuke Takahashi, Satoru Yamazaki et Yasunori Shintani

Département de biochimie médicale, École supérieure des sciences biologiques frontalières de l'Université d'Osaka, Suita, Osaka, Japon

Yuya Nishida, Takashi Iwamoto, Chisa Nakabayashi, Hisakazu Kato, Tasneem Qaqorh, Seiji Takashima et Yasunori Shintani

École supérieure des sciences, Université de Hyogo, Hyogo, Japon

Sachiko Yanagisawa, Kyoko Shinzawa-Itoh, Waka Matsumura, Kazumasa Muramoto, Yoshitsugu Shiro et Minoru Kubo

Centre des sciences informatiques, Université de Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japon

Rikuri Morita, Ryuhei Harada et Yasuteru Shigeta

Centre RIKEN SPring-8, 1-1-1 Kouto, Sayo, Hyogo, Japon

Hideki Shigematsu, Chai Gopalasingam et Takehiko Tosha

Centre RIKEN pour la recherche sur la dynamique des biosystèmes, Yokohama, Kanagawa, Japon

Hitomi Yuki et Teruki Honma

Département de chimie, École supérieure des sciences, Université de Chiba, Inage, Chiba, Japon

Satoshi Ogasawara et Takeshi Murata

Département de bactériologie I, Institut national des maladies infectieuses, Tokyo, Japon

Ken Shimuta, Hideyuki Takahashi, Yukihiro Akeda et Makoto Ohnishi

Centre de recherche sur la résistance aux antimicrobiens, Institut national des maladies infectieuses, Tokyo, Japon

Ken Shimuta

Centre d'apprentissage intégré de l'éducation de base, Institut de technologie de Kanagawa, Atsugi, Kanagawa, Japon

Katsumasa Kamiya

Division de l'analyse des cristaux de protéines, Institut japonais de recherche sur le rayonnement synchrotron, SPring-8, Sayo, Hyogo, Japon

Nobuhiro Mizuno et Takashi Kumasaka

Département de microbiologie et des maladies infectieuses, École de médecine de l'Université de Toho, Tokyo, Japon

Yoshikazu Ishii

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Y.Shintani a conçu le projet et réalisé le criblage des inhibiteurs de mtCcO. Y.Shintani et YN ont conçu la stratégie expérimentale et analysé les données. YN a effectué une cristallographie aux rayons X, une analyse de particules uniques cryo-EM, un criblage de composés in silico et la plupart des expériences biochimiques. S.Yanagisawa a effectué des expériences spectroscopiques de résonance Raman et a analysé les données avec WM et MKRM a effectué une simulation MD et a analysé les données avec KK, RH, HY, YN et Y.Shigeta. HS a effectué l'acquisition de données cryo-EM et a aidé à l'analyse des données. NM et TK ont contribué à la collecte de données cristallines et ont aidé à l'analyse structurale aux rayons X. KSI a fourni des cristaux de mtCcO et de mtCcO bovins purifiés tout au long du projet. YN a effectué un criblage de composés in silico avec HY sous la supervision de THSO et TM a généré les anticorps monoclonaux pour l'analyse cryo-EM de la bo3 oxydase. KS, HT, YA et MO ont fourni les souches de N. gonorrhoeae et effectué la détermination de la CMI. YI a analysé et fourni des conseils sur les expériences de N. gonorrhoeae. TI a réalisé l'expérience biochimique bo3. Le CN a réalisé une expérience biochimique sur Neisseria meningitidis bb3 qNOR. HK a effectué une mesure OCR à l'aide de XFe96 Fluxanalyser. S.Yamazaki, TN, TQ et YT ont effectué une analyse des données, y compris une analyse phylogénique et une préparation des figures. CG, KM, TT et Y.Shiro ont fourni l'enzyme bb3 qNOR, la construction d'expression et le cadre expérimental pour qNOR. Y.Shintani, YN a préparé le manuscrit original. ST a aidé à la révision du manuscrit original et a obtenu un financement. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance à Yasunori Shintani.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Nishida, Y., Yanagisawa, S., Morita, R. et al. Identification des antibiotiques sur la base des différences structurelles dans l'allosterie conservée des hème-cuivre oxydases mitochondriales. Nat Commun 13, 7591 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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Reçu : 15 mai 2022

Accepté : 07 novembre 2022

Publié: 08 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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