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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1545 (2023) Citer cet article

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La principale protéase du SRAS-CoV-2 (Mpro) est responsable du clivage de la polyprotéine virale. L'auto-traitement de Mpro est appelé maturation et il est crucial pour la dimérisation et l'activité des enzymes. Ici, nous utilisons C145S Mpro pour étudier la structure et la dynamique du clivage N-terminal en solution. L'analyse par spectroscopie de masse native montre que les états oligomères mixtes sont composés de particules clivées et non clivées, indiquant que le traitement N-terminal n'est pas critique pour la dimérisation. Une structure cryo-EM de 3,5 Å fournit des détails sur le clivage Mpro N-terminal en dehors des contraintes de l'environnement cristallin. Nous montrons que différentes classes d'inhibiteurs modifient l'équilibre entre les états oligomères. Alors que l'inhibiteur non covalent MAT-POS-e194df51-1 empêche la dimérisation, l'inhibiteur covalent nirmatrelvir induit la conversion des monomères en dimères, même avec des N-terminaux intacts. Nos données indiquent que la dimérisation Mpro est déclenchée par un ajustement induit en raison de la liaison covalente pendant le traitement du substrat plutôt que le traitement N-terminal.

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est l'agent causal du COVID-191. Comme le SARS-CoV et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), le SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin (ssRNA) qui appartient au genre des bêta-coronavirus1,2. Le génome du SRAS-CoV-2 est composé de près de 30 000 nucléotides qui contiennent le gène ORF1ab, un grand cadre de lecture ouvert (ORF) responsable du codage de 16 protéines non structurelles (nsp) sous forme de deux polyprotéines après le décalage du cadre ribosomal, nommées 1a et 1b1,2,3. Le traitement protéolytique des polyprotéines virales est essentiel pour le cycle de vie viral, et il est effectué par deux protéases à cystéine codées par le SRAS-CoV-2 : la protéase de type papaïne (PLpro), qui est l'un des domaines de nsp3, et la protéase principale virale (Mpro ou 3CLpro), codé par le nsp54,5. PLpro clive la polyprotéine virale en trois sites, tandis que Mpro est responsable du clivage de la polyprotéine en onze sites distincts4,5, y compris ses propres extrémités N et C6. Mpro est l'une des cibles les plus prometteuses pour le développement de médicaments contre le SARS-CoV-25,7. Toutes les informations structurelles et biochimiques recueillies sur cette cible ont été cruciales pour le développement rapide de nouveaux antiviraux8,9,10,11, y compris le récent médicament Paxlovid/nirmatrelvir10, approuvé pour une utilisation d'urgence aux États-Unis, en Europe et en Chine.

Pour obtenir une Mpro mature exprimée hétérologue, les chercheurs ont adopté la stratégie générale consistant à ajouter la partie C-terminale nsp4 à la partie N-terminale des constructions nsp5, permettant l'auto-clivage et la dimérisation de Mpro in vitro6. Auparavant, nous avons décrit l'activité et le profil biochimique du mutant SARS-CoV-2 Mpro C145S contenant la partie C-terminale de nsp4 à son N-termini6. Cette mutation de la sérine a généré une version active mais beaucoup plus lente de Mpro, un outil précieux pour étudier les aspects biochimiques de cette enzyme. Contrairement au dimère Mpro, cet échantillon s'est comporté comme un mélange dynamique de monomères, dimères, trimères et tétramères en solution6. L'activité résiduelle de ce mutant de la sérine a permis le clivage lent du peptide N-terminal nsp4-nsp5, ce qui nous a permis de surveiller les états oligomériques de Mpro en solution au cours du processus de maturation6. Nous avons observé que la forme tétramérique de Mpro C145S atteint l'équilibre sous forme de dimères au cours de deux jours, dans un phénomène qui est directement proportionnel au clivage N-terminal, déduisant ainsi que le traitement N-terminal était critique pour la dimérisation6. De plus, nous avons précédemment révélé la structure cristalline de Mpro C145S en complexe avec le peptide C-terminal nsp5-nsp6, obtenu à partir de l'échantillon tétramérique Mpro, présentant une description détaillée de cet événement clé de maturation par clivage. En résumé, deux dimères Mpro matures s'assemblent dans un complexe transitoire dimère-dimère, positionnant le C-terminal d'une molécule Mpro vers le site actif d'une autre, et suivis d'un traitement C-terminal dans un événement de clivage trans6.

Nous rapportons ici la structure de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) du mutant SARS-CoV-2 Mpro C145S contenant la partie de clivage nsp4-nsp5, à une résolution de 3,5 Å. Dans cette structure, nous entrevoyons l'état en solution de Mpro, lié à deux protomères nsp5 dépliés lors du traitement N-terminal. Nous démontrons que la dimérisation ne dépend pas du traitement N-terminal, comme supposé précédemment, mais probablement une conséquence de l'ajustement induit requis pour la liaison covalente pendant le traitement du substrat.

L'analyse par spectroscopie de masse native des pics contenant des multimères de SARS-CoV-2 Mpro C145S a révélé que l'échantillon est composé d'un mélange de monomères, dimères, trimères et tétramères (Fig. 1), comme indiqué précédemment par l'analyse SEC-MALS6. De plus, nous avons observé des particules de monomères contenant des séquences de peptides nsp4-nsp5 non clivés pliés et dépliés. Conformément à notre précédent modèle de maturation, dans lequel le clivage du peptide N-terminal sert de déclencheur à la dimérisation.

De gauche à droite, les pics montrent des monomères clivés (demi-cercle bleu) et non clivés (demi-cercle rouge), des dimères formés par des particules clivées (cercles bleus) ou semi-clivées (cercle bleu-rouge), des trimères formés par deux particules clivées et une non clivée ( deux tiers bleus, un tiers cercles rouges) et des tétramères formés par deux particules clivées et deux non clivées (deux quarts bleus, deux quarts rouges). Des pics mineurs d'autres formes sont décrits dans des documents supplémentaires. Les graphiques ont été tracés à partir d'expériences individuelles de spectrométrie de masse native.

Cependant, la spectroscopie de masse native a également révélé que les pics contenant des états oligomères pouvaient être formés par la combinaison de particules nsp4-nsp5 non clivées (masse théorique de 34 554,54 Da) et clivées (masse théorique de 33 780,58 Da). Il en va de même pour les pics de trimères ou de tétramères, qui pourraient étonnamment être composés de toutes les possibilités combinatoires de peptides clivés et non clivés (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaire). Cela contredit les modèles préliminaires de maturation de Mpro, dans lesquels le traitement N-terminal dicte la dimérisation6,12,13. Il est également clair par les quantités relatives de masse que les équilibres des états oligomères favorisent les états où plus d'éléments clivés sont présents (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaire), ce qui convient toujours à ce modèle où le clivage N-terminal est directement impliqué dans la dimérisation. .

Pour confirmer ces résultats, nous avons effectué une analyse par spectroscopie de masse native secondaire de l'échantillon 2 en utilisant une configuration différente. À l'aide d'un UHMR Orbitrap Q-Exactive, sept distributions d'état de charge ont été observées. Nous avons comparé les données avec l'exécution précédente de l'instrument Agilent dans la Fig. 6 supplémentaire. Une distribution d'état de charge abondante près de m/z ~ 2500 et centrée sur l'ion 11+ correspond à Mpro avec une masse moléculaire de 34 556 ± 24 Da (m1 dans la Fig supplémentaire . 6). Une distribution d'état de charge à faible abondance avec une amplitude similaire de la charge est également observée, ce qui correspond à une espèce de masse 33 865 ± 44 Da (m2 dans la Fig. 6 supplémentaire). Ces deux distributions d'état de charge peuvent être attribuées aux différents monomères Mpro. Plusieurs séries de pics peuvent être trouvées entre m / z 4000 et 5000 (tous centrés à l'état de charge 16 + ), qui correspondent à des ions avec des poids moléculaires compatibles avec les homodimères m1m1 et m1m2, c'est-à-dire 67 687 ± 44 Da pour les homodimères et 68 466 ± 9 Da pour les hétérodimères. Fait intéressant, les pics supplémentaires dans le spectre correspondent à l'état de charge qui déconvolue vers des poids moléculaires compatibles avec les états oligomères d'ordre supérieur, avec différentes quantités de m1 et m2. Pourtant, les données montrent que l'échantillon 2 est composé de particules natives combinant des protomères clivés et non clivés, confirmant notre observation précédente.

Nous décrivons ici la structure cryo-Em du SARS-CoV-2 Mpro C145S à 3,5 Å (Fig. 2). Le modèle final a montré que les 306 résidus de C145S Mpro étaient visibles pour les deux chaînes, ainsi que des preuves claires d'un peptide long d'au moins 11 résidus occupant les deux sites actifs (Fig. 3a). Le modèle final ne montrait aucun rotamère, aucune valeur aberrante Cβ ou Ramachandran et un coefficient de corrélation carte-modèle (CC) de 0, 80 (Fig. 3b, c). Modèle et/ou carte ont été déposés sous les codes 8EY2 (pour PDB) et EMD-28666 (pour EMDB). Le modèle cryo-EM final est très similaire aux structures connues aux rayons X (Fig. 3d), avec un RMSD de 0, 7 Å (pour 3 909 atomes) par rapport à la forme dimère mature de Mpro (PDB 7KPH), ou 1, 2 Å (pour 3 822 atomes) par rapport à la structure aux rayons X du mutant C145S (PDB 7N5Z) (Fig. 3d et e). Les statistiques et les paramètres de la collecte et du traitement des données sont disponibles dans le tableau 1.

a Micrographies alignées, avec barre d'échelle en bas. b Fonction CTF calculée à partir des micrographies obtenues. c Exemples de particules extraites. d Schéma détaillé des étapes suivies pour la reconstruction finale, mettant en évidence les classes 2D et 3D obtenues et la première reconstruction à haute résolution. e Corrélation en coquille de Fourier (FSC) entre les demi-cartes des reconstructions finales. En haut, le graphique montre les FSC par rapport à la fréquence spatiale calculée dans les directions x (bleu), y (vert) et z (rouge). La phase de cos moyen est en noir et le FSC global est tracé en jaune. En bas, pourcentage de FSC par angle (bleu) superposé avec le tracé FSC étalon or (rouge). f Résolution locale projetée sur la carte finale à partir de deux orientations.

une vue de rotation sur quatre côtés de la carte finale affichée sous forme de surface, avec les chaînes A et B colorées en blanc et gris, respectivement, et la carte peptidique du site actif colorée en cyan. b Modèle de domaine III de la chaîne A (bleu) intégré à la carte finale (gris). c Région d'interface des chaînes A (bleu) et B (saumon) insérée dans la carte cryo-EM finale (gris). d Superposition du modèle X-ray Mpro (jaune, PDB 7KPH), du modèle X-ray SARS-CoV-2 C145S Mpro (rose, PDB 7N5Z) et du modèle SARS-CoV-2 C145S Mpro cryo-EM (bleu foncé). e SARS-CoV-2 C145S Chaîne de modèle cryo-EM Mpro A (à gauche) et (à droite) colorée selon son RMSD par rapport au modèle de rayons X de Mpro (PDB 7KPH).

Il a été précédemment supposé que l'échantillon tétramérique de Mpro C145S observé dans la solution avait la même organisation que celui obtenu avec la structure cristalline de l'association dimère-dimère6. Cependant, la structure cryo-EM de Mpro C145S a révélé une particule dimérique de Mpro ancrée à la région nsp4-nsp5 au moment qui précède le clivage, avec une densité détaillée des résidus clés P et P '(Fig. 3a). La structure de résolution de 3, 5 Å fournit des informations structurelles sur une étape importante de la maturation de Mpro, le clivage N-terminal, présentant une densité électronique claire du peptide dans les deux chaînes A et B du dimère (Fig. 3a). La carte du potentiel électrique autour du site actif Ser145* indique une interaction non covalente du peptide nsp4/nps5 (résidus SAVLQ de nsp4 et résidus 1-6 de nsp5 Mpro, SGFRKM), formant un feuillet β étendu maintenu majoritairement par des liaisons hydrogène à Thr24, Gly143, Ser145 *, His163, Glu166 et Gln189 (Fig. 4a). Les positions du substrat présentaient une position de liaison très proche des structures cristallographiques de Mpro en complexe avec le substrat peptidique physiologique (PDBid 7N6N et 7DVP) avec des valeurs RMSD respectivement de 0,57 et 0,9 calculées entre 30 et 54 atomes.

a Vue du site actif de la surface de la chaîne A de Mpro C145S (en gris) liée au peptide nsp4-nsp5 (bâtonnets jaunes). Les sous-sites sont notés de S4 à S5'. b Vue détaillée des résidus du site actif de la chaîne A de Mpro C145S (en gris) liés au peptide nsp4-nsp5 (bâtonnets jaunes), avec la carte cryo-EM montrée comme surface (niveau de contour de 4,55). c Schéma d'interaction entre le peptide nsp4-nsp5 et la chaîne A de Mpro C145S. d Particules filtrées passe-bas sélectionnées, mettant en évidence les particules dimères (marquées d'une ligne bleue) liées à des particules monomériques non clivées (marquées d'une ligne rouge). La barre d'échelle est affichée en bas à gauche. e Représentation schématique du dimère Mpro C145S (bleu) lié à des particules non clivées (rouge).

Dans le modèle cryo-EM, nous pouvons voir Gln0 occuper le sous-site S1, avec son fragment de chaîne latérale NE2 interagissant avec l'atome OE1 du résidu Glu166 via une liaison hydrogène (2,7 Å et 2,5 Å pour les chaînes A et B, respectivement). De plus, l'atome OG de Ser145* forme une liaison hydrogène avec le groupe hydroxyle de la chaîne principale de Gln0. L'amide de la chaîne principale Gly143 donne une liaison hydrogène à l'oxygène carbonyle P1 ', stabilisant le trou oxyanion pendant la catalyse. Leu-1 au niveau du sous-site S2 interagit avec Gln189 via une liaison hydrogène formée entre l'amide de la chaîne principale de Leu-1 et la chaîne latérale OE1 de Gln189 (Fig. 4a, b). Met49, Met149 et Gln189 du sous-site S2 assument une conformation plus ouverte par rapport aux formes non liées capturées de l'enzyme. Au sous-site S3, il existe une interaction entre les atomes polaires de la chaîne principale Val-2 et de la chaîne latérale Glu166 (Fig. 4c). Le groupe hydroxyle de la chaîne principale Ala-3 dans P4 donne une liaison hydrogène à NE2 de Gln189. L'absence d'interactions polaires entre les sites protéiques S2-S4 avec les résidus protéiques aiderait à expliquer la variété d'acides aminés distincts que ces positions sont prêtes à accueillir. La carte de densité de la particule Mpro ancrée au site actif ne s'étend que vers les résidus Met6 de Mpro, ce qui suggère que le reste de la particule est trop mobile pour la reconstruction du modèle.

En inspectant soigneusement les particules filtrées passe-bas utilisées pour la reconstruction finale, nous avons remarqué une particule satellite allongée ancrée autour de chacune des régions de sites actifs dimères, avec une taille et une forme compatibles avec un monomère partiellement replié de Mpro (Fig. 4d). Contrairement au complexe dimère-dimère formé lors du clivage C-terminal, ces protomères allongés sont répartis de manière aléatoire autour du site actif, indiquant que les particules sont mal repliées (Fig. 4d, e). De plus, les particules allongées en forme de monomères nsp5 ne semblent pas former de dimères (Fig. 4e). Ces observations sont conformes à notre modèle précédent de Mpro immature, dans lequel nous avons montré que l'ajout de trois acides aminés non clivables à ses extrémités N perturbe le repliement de Mpro et empêche la dimérisation6. Néanmoins, notre structure révèle une vision unique de la forme dimérique de Mpro capturée lors du clivage de l'extrémité N-terminale en solution. Nous n'avons pas pu générer de classes 2D ou 3D mettant en évidence les particules satellites, ce qui est en accord avec l'hypothèse partiellement repliée.

De nombreuses simulations moléculaires in silico et études d'amarrage ont tenté de décrire Mpro dans le mouvement de la solution et la reconnaissance du substrat14,15, aucun modèle déterminé expérimentalement n'est disponible pour les valider sans l'enceinte des contraintes cristallines. Ici, nous avons utilisé le modèle cryo-EM pour étudier la dynamique de Mpro lors du clivage N-terminal. Pour cela, les particules utilisées pour la reconstruction du modèle ont été analysées à l'aide de l'outil cryoSPARC 3DVA pour le tri en solution de la variabilité de Mpro. La première des quatre composantes de vecteurs propres explorées a généré des volumes de faible qualité qui n'étaient pas interprétables. Les trois autres (composants 2, 3 et 4) ont produit des cadres volumiques qui ont été utilisés pour l'analyse de la variabilité des particules. Dans les trois, on peut voir un volume avec la forme de Mpro lié au peptide nsp4 dans les deux sites actifs, suggérant que des particules d'autres états oligomériques ont été filtrées lors du traitement des données. Comme prévu, l'analyse indique que la plasticité conformationnelle la plus élevée est concentrée dans la région du site actif de Mpro, avec la RMSD la plus élevée concentrée dans les régions de l'hélice 43-53 et dans les épingles à cheveux β 19-27, 62-65 et 166. -171. L'hélice 43-53 contient des résidus clés impliqués dans la formation du sous-site hydrophobe S2, y compris Met49. Avec Met165, Met49 forme une cavité de reconnaissance de substrat, avec une préférence pour les chaînes latérales hydrophobes telles que la leucine et la valine6. L'épingle à cheveux β 19-27, responsable de la formation du sous-site S1 ', semble également être remarquablement mobile par rapport au reste de la protéine.

L'analyse indique que les deux sites actifs s'étendent et se contractent progressivement sur les cadres (Fig. 2 supplémentaire). L'expansion du site actif de Mpro était déjà corrélée avec la liaison au substrat et au ligand6,16, il est donc probable que cette variabilité soit corrélée à des moments distincts d'ancrage au substrat. La flexibilité conformationnelle du site actif de Mpro lors de la liaison du substrat et du ligand a déjà été observée en utilisant la cristallographie aux rayons X cryogénique et à température ambiante6,17. Kneller et al. ont démontré que pendant la liaison du ligand, les éléments structurels secondaires qui forment les sous-sites P2-P5 sont chassés de la position d'origine pour l'hébergement ligand/substrat jusqu'à 2,4 Å, modifiant la forme et le potentiel électrostatique du site17. Les mouvements d'expansion-contraction du site actif semblent être symétriques pour les deux protomères Mpro (Fig. 2 supplémentaire). Cela diffère considérablement de plusieurs études in silico qui ont démontré que les protomères Mpro sont indépendamment actifs18,19,20, mais aideraient à expliquer pourquoi la dimérisation est essentielle pour une efficacité enzymatique complète. La plasticité du site actif des coronavirus en solution Mpro est essentielle pour comprendre la dynamique enzymatique et devrait aider les campagnes de découverte de médicaments, en particulier pour les plateformes reposant sur l'analyse in silico de l'interaction protéine-ligand, qui souvent ne sont pas corrélées avec les données expérimentales21.

L'échantillon C145S Mpro s'est avéré être un outil précieux pour étudier le comportement in vitro de Mpro 6. Ici, nous explorons la capacité de notre méthode à explorer l'étude de l'effet d'inhibiteurs puissants sur la maturation enzymatique. Notre premier objet était l'inhibiteur non covalent compétitif MAT-POS-e194df51-1, développé par l'initiative COVID Moonshot, avec un pIC50 de 7,5. Des échantillons contenant du C145S Mpro monomère (échantillon 1) ou du C145S Mpro tétramérique (échantillon 2) ont été incubés avec deux concentrations de MAT-POS-e194df51-1, et leur état oligomérique a été surveillé pendant 48 h par SEC-MALS et comparé avec contrôle. Pour simplifier, les trimères ont été considérés comme faisant partie du pool de tétramères.

À 0 h, l'échantillon 1 témoin présentait un rapport de 1,0/0,0 (monomère/dimère), passant à 0,88/0,12 à 24 h et 0,39/0,61 à 48 h (Fig. 5a). En ce qui concerne l'échantillon 1 contenant 4: 1 MAT-POS-e194df51-1 / protéine, il est resté à un rapport de 1, 0 / 0, 0 monomère / dimère entre 0 h et 24 h, ne progressant qu'à 0, 004 / 0, 996 au bout de 48 h (Fig. 5b). La réduction du rapport molaire MAT-POS-e194df51-1/protéine de 4:1 à 0,4:1 a ramené le comportement à un niveau plus proche de celui du témoin, atteignant un rapport monomère/dimère de 0,89/0,11 à 24 h et de 0,74/0,25 à 48h. L'échantillon 1 a montré que les monomères dépliés forment essentiellement des dimères entièrement matures au fil du temps. MAT-POS-e194df51-1 à l'échantillon 1, les deux concentrations semblent inhiber la maturation des dimères et provoquer l'accumulation de particules de monomères dépliées. Grâce à cette expérience, nous avons pu démontrer un effet unique de MAT-POS-e194df51-1 sur le cycle enzymatique qui n'a jamais été observé, montrant non seulement sa capacité à entrer en compétition avec le substrat mais également à bloquer le cycle de maturation enzymatique et à accumuler des polyprotéines non clivées. En 2018, Constant et al ont démontré pour la protéase de la dengue NS3 que les inhibiteurs les plus efficaces devraient cibler spécifiquement les sites de clivage qui accumuleraient des précurseurs de protéines virales non clivées22. Dans ce cas, ce phénotype inhibé pourrait inhiber de manière trans-dominante d'autres phénotypes viraux intracellulaires, supprimant éventuellement la génération de variants résistants aux médicaments. D'autres études seront nécessaires pour comprendre l'effet des éléments non clivés dans le métabolisme du SRAS-CoV-2.

a Réaction témoin contenant des monomères à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas). b Réaction de conversion des monomères en présence de l'inhibiteur non covalent MAT-POS-e194df51-1 à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas). c Réaction de conversion des monomères en présence de l'inhibiteur covalent Nirmatrelvir à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas).

Pour le contrôle de l'échantillon 2, nous avons vu le rapport de 0,43/0,34/0,23 masse de protéine monomère/dimère/tétramère détectée à 0 h, passant à 0,09/0,89/0,02 à 24 h et 0,0/0,98/0,02 à 48 h (Fig. 6a). Pour l'échantillon 2 contenant 4:1 MAT-POS-e194df51-1/protéine, nous avons vu le rapport de 0,49/0,45/0,05 masse de protéine monomère/dimère/tétramère détectée à 0 h, passant à 0,49/0,51/0,0 à 24 h et 0,45/0,55/0,02 à 48h (Fig. 6b). Pour l'échantillon 2 contenant 0,4:1 MAT-POS-e194df51-1/protéine, nous avons vu le rapport de 0,46/0,47/0,06 masse de protéine monomère/dimère/tétramère détectée à 0 h, passant à 0,26/0,73/0,0 à 24 h et 0,02/0,96/0,02 à 48h.

a Réaction témoin contenant des tétramères à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas). b Réaction de conversion des tétramères en présence de l'inhibiteur non covalent MAT-POS-e194df51-1 à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas). c Réaction de conversion des tétramères en présence de l'inhibiteur covalent Nirmatrelvir à 0 h (en haut), après 24 h d'incubation (au milieu) et après 48 h (en bas).

Sur le contrôle de cette expérience, nous avons vu que l'échantillon s'initie sous la forme d'un mélange de tétramères, dimères et monomères. Au cours de 48 h, les monomères et les tétramères sont éteints, et les dimères sont devenus prédominants. La présence de MAT-POS-e194df51-1 sur l'échantillon 2 semble provoquer le même effet que dans l'échantillon 1 de blocage de la consommation de monomères, mais semble également accélérer la consommation de tétramères. Si l'on considère les échantillons tétramères comme étant le complexe enzyme-substrat, il est logique qu'un inhibiteur compétitif ait cet effet sur l'échantillon car il provoque la dislocation du substrat déplié qui est lié au site actif Mpro. Parallèlement à l'échantillon 1, la conversion des monomères de l'échantillon 2 en dimères a également été bloquée par la présence de MAT-POS-e194df51-1, révélant que l'inhibiteur non seulement bloque l'activité, mais pourrait également empêcher le processus de maturation, améliorant éventuellement l'effet antiviral au-delà de son puissance à la cible.

L'effet de l'inhibiteur covalent de Mpro Nirmatrelvir/PF-07321332 avec un pIC50 de 7,710 a également été testé avec des échantillons C145S. L'effet de cette molécule était remarquablement différent de celui de MAT-POS-e194df51-1 (Fig. 5c). Pour l'échantillon 1 contenant 4:1 Nirmatrelvir/protéine, nous avons vu le rapport de 0,65/0,35 entre la masse de protéines monomères/dimères détectée à 0 h, passant à 0,06/0,94 à 24 h et 0,02/0,98 à 48 h (Fig. 5c) . Pour l'échantillon 2 contenant 4:1 Nirmatrelvir/protéine, nous avons vu le rapport de 0,31/0,56/0,12 entre la masse de protéines monomères/dimères/tétramères détectée à 0 h, passant à 0,0/0,88/0,12 à 24 h et 0,0/0,98/0,02 à 48h (Fig. 6c).

Dans l'échantillon 1, la présence de nirmatrelvir induit fortement la formation de dimères à partir de monomères même à zéro heure et améliore significativement le rapport de formation de dimères dans le temps, avec une conversion presque complète après 24 h (Fig. 5c). Dans l'échantillon 2, l'équilibre des monomères et des tétramères semble également être disloqué pour favoriser la formation de dimères (Fig. 6c). Alors que pour le tétramère, l'augmentation de la consommation pouvait s'expliquer simplement par la compétition entre le nirmatrelvir et le complexe substrat-enzyme, le taux accéléré de conversion des monomères en dimères était complètement inattendu. Pourtant, ces résultats uniques pourraient éclairer les détails de la première étape de la maturation des protéines, le traitement N-terminal.

Notre modèle initial pour cette étape était que le clivage N-terminal est un mélange d'événements cis et trans, et son clivage approprié éliminerait l'encombrement stérique qui empêcherait la dimérisation6, ce qui était conforme aux modèles précédents pour le SRAS-CoV Mpro 12,13. Cependant, le fait que l'inhibiteur covalent (mais pas non covalent) puisse induire une dimérisation dans un échantillon non clivé suggère que le déclencheur de la dimérisation n'est pas le traitement N-terminal, mais l'ajustement induit causé par la liaison covalente elle-même. . Ce modèle expliquerait également pourquoi les oligomères peuvent être formés par la combinaison de particules non clivées et clivées plutôt que de particules clivées uniquement (Fig.1 supplémentaire).

Pour confirmer cette hypothèse, nous avons cristallisé des monomères Mpro C145S en présence de Nirmatrelvir. La structure cristalline a révélé que malgré la mutation C145S, le nirmatrelvir est lié de manière covalente à la protéine. Néanmoins, nous avons également observé le déplacement des hélices Mpro αF, αH et αI du domaine III adjacent, qui semble être causé par l'encombrement stérique des acides aminés N-terminaux non clivés (Fig. 7). C'est comme notre structure précédente de Mpro immature, à l'exception que nous ne voyons pas le déplacement des résidus de site actif Phe140, Glu166, Pro168 et Gln1896. Cela suggère que la liaison covalente permet le remodelage approprié du site actif, permettant l'événement de dimérisation même en l'absence d'un clivage N-terminal approprié. On pourrait en déduire que pour empêcher la dimérisation, un inhibiteur doit être non covalent et inhiber avec succès la forme monomérique de Mpro se liant à tous les onze sites de clivage distincts au niveau de la polyprotéine virale.

Les carbones alpha Ser1 et Gln-1 sont mis en évidence sous forme de sphères rouges. Le Mpro natif est représenté par un dessin animé gris transparent, avec le carbone alpha Ser1 mis en évidence par une sphère verte.

Si l'on combine la structure cryo-EM du mutant C145S lié à un peptide non clivé avec notre précédente structure aux rayons X des chaînes A de C145S (PDB 7N6N) (peptide clivé lié de manière covalente à Ser145) et de la chaîne B (peptide post-clivé), nous peut entrevoir les modifications structurelles de Mpro au cours de toutes les étapes du traitement enzymatique (Fig. 8). Ces structures révèlent que le processus enzymatique commence par des acides aminés clés positionnés de manière similaire à l'apo-structure (Fig. 8a), mais la boucle β166-171 doit être poussée vers le noyau de l'enzyme pour accueillir les peptides substrats P3-P5 (Fig. 8b). Ensuite, lors de l'intermédiaire covalent enzyme-substrat, cette boucle β166-171 doit être poussée encore plus loin dans le noyau de l'enzyme pour permettre une distance covalente plus courte entre C/S145 et le carbonyle C à liaison scissile et un ancrage correct au site actif, tandis que les hélices 43-53 et 62-65 montrent une conformation lâche (Fig. 8c). Après clivage, le peptide produit n'est plus lié à C/S145, permettant au domaine du site actif de revenir à sa conformation apo (Fig.8d). Au cours de ce processus, la surface du site actif de Mpro subit d'importantes modifications de potentiel structurel et électrostatique pour s'adapter à toutes les conformations intermédiaires enzyme-substrat, maintenant détaillées dans cette série de structures (Fig. 8).

a Résidus du site actif clé (bâtonnets verts) de Mpro sous forme apo (en haut), vue de dessin animé du site actif à l'état apo en jaune (au milieu) et potentiel électrostatique calculé projeté dans la surface du site actif de Mpro (en bas). b Résidus du site actif clé (bâtonnets verts) de Mpro C145S liés au peptide intact (en haut), vue de dessin animé du site actif à partir de la forme respective (au milieu) et potentiel électrostatique calculé projeté de la forme respective (en bas). c Résidus du site actif clé (bâtonnets verts) de Mpro C145S liés de manière covalente au peptide clivé formant le complexe intermédiaire enzyme-substrat (en haut), vue de dessin animé du site actif à partir de la forme respective (au milieu) et potentiel électrostatique calculé projeté de la forme respective (en bas ). d Résidus du site actif clé (bâtonnets verts) de Mpro C145S dans un complexe avec un peptide post-clivé (en haut), vue de dessin animé du site actif à partir de la forme respective (au milieu) et potentiel électrostatique calculé projeté de la forme respective (en bas). Les bâtons transparents et les dessins animés (gris) dans les figures du haut et du milieu représentent la position structurelle à partir des éléments relatifs de l'étape précédente.

Le SARS-CoV-2 Mpro est une protéine à trois domaines de 34 kDa qui est essentiellement active en tant que dimère5,6. Depuis que la première structure radiographique du SARS-CoV-2 Mpro a été déposée à la Protein Data Bank (PDB) sous le code 6LU7 en février 202023, ce sont près de 450 structures à jour de Mpro disponibles à la PDB jusqu'à 1,2 Å résolution (PDB 7K3T), faisant du Mpro l'un des nsp du SARS-CoV-2 les mieux caractérisés sur le plan structurel33. Le Mpro a été caractérisé par rayons X en complexe avec de multiples nouveaux candidats médicaments5,24,25,26,27 et des molécules de repositionnement24,28,29, des fragments de grandes campagnes de criblage de fragments30, ainsi que des peptides endogènes6,16,31 et des peptides -candidats médicaments mimétiques32. De plus, les structures de rayons X à température ambiante et cryogénique et la cristallographie neutronique ont été utilisées avec succès pour fournir des informations précieuses pour détailler le mécanisme d'action de Mpro ainsi que les changements de conformation lors de la reconnaissance du substrat et du ligand6,17. Pourtant, la structure cryo-EM de Mpro rapportée ici révèle des caractéristiques uniques de la reconnaissance enzyme-substrat et de la dynamique en solution.

Nous avons également montré que le clivage Mpro N-terminal est important pour le bon repliement de la protéine, mais pas critique pour la dimérisation. Nos données suggèrent que l'événement de dimérisation est régi par l'ajustement induit de la protéine lors de la formation d'une liaison covalente lors du clivage. Cela signifie probablement que le clivage de l'un des onze sites cibles Mpro viraux servirait de déclencheur pour la dimérisation, quel que soit l'état de l'extrémité N-terminale. Ces observations divergent des modèles proposés précédemment, dans lesquels le cis-clivage de N et C-terminal entre deux protomères est nécessairement l'étape initiale du processus de maturation13,34. En fait, des études antérieures avaient montré que la dimérisation induite par le substrat pouvait se produire dans un modèle in vitro de la polyprotéine virale, où N et C-terminal sont liés à d'autres protéines35. Notre modèle pourrait également expliquer pourquoi les études de Mpro qui ont utilisé d'autres stratégies de production de protéines qui ont généré une extrémité N-terminale authentique, comme les cas de MERS-CoV Mpro où les auteurs ont opté pour l'utilisation de la thrombine à l'extrémité N-terminale (donc, ne permettant pas à la protéine de effectuer un clivage interne et une maturation complète) avait généré une protéine qui se comporte principalement comme des monomères 36. Curieusement, les auteurs ont également signalé que la dimérisation du MERS-CoV Mpro pourrait être déclenchée par le substrat, ce qui est également en accord avec notre mode proposé36. Pourtant, plus de données sont nécessaires pour conclure que les Mpro naissants sont traités et convertis en matures, et si ce processus dépend de l'événement de traitement, de la particule traitée ou d'une combinaison des deux. Ces observations impactent notre compréhension du processus de maturation des coronavirus Mpro, ainsi que les différences pharmacodynamiques entre les inhibiteurs covalents et non covalents.

Les détails de la planification de la construction, du clonage et de l'expression des protéines sont donnés ailleurs6. En bref, la matrice d'ADNc viral (GenBank MT126808.1), gracieusement fournie par le Dr Edison Durigon (Université de São Paulo, São Paulo, Brésil), a été utilisée pour cloner la région codante de la région codante de Mpro (résidus 3264-3569) en utilisant des amorces : Fw 5' CAGGGCGCCATGAGTGGTTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' et Rv 5' GACCCGACGCGGTTATTGGAAAGTAACACCTGAGAC 3'. Cette séquence a été insérée dans le vecteur pET_M11 en utilisant la méthode LIC37. Ce plasmide a ensuite été utilisé comme matrice pour l'insertion des résidus N-terminaux natifs de Mpro (GAMSAVLQ ↓ SGFRK) par PCR inverse en utilisant les amorces : Fw : 5' GCTGCAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' et Rv : 5' ACGGCTGACATGGCGCCCTGAAAATA 3'. Ensuite, la mutation C145S a été insérée dans ce plasmide par PCR inverse en utilisant les amorces Fw 5' CCTTAATGGTTCATCTGGTAGTG 3' et Rv 5' AATGAACCCTTAATAGTGAAATTGG 3', résultant en pET_M11-C145S-Mpro. Cette construction contient une étiquette histidine N-terminale 6x suivie d'un site de clivage TEV, et les acides aminés de la séquence de reconnaissance C-terminale nsp4 (Ser-4, Ala-3, Val-2, Leu-1, Gln-0 ↓ ) suivis par la séquence Mpro contenant la substitution C145S6.

Pour la production de protéines, pET_M11-C145S-Mpro a été utilisé pour transformer des cellules E. coli BL21 et cultivé dans du milieu ZYM-505238 à 37 oC et 200 tr/min jusqu'à une DO600 de 0,8, suivi d'une expression à 18 °C, 200 tr/min pendant 16 h . Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 40 min à 4 ° C, remises en suspension dans un tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) et rompues par sonication. Le lysat contenant la protéine soluble a été clarifié par centrifugation à 12,00 x g pendant 30 min à 4 °C.

C145S Mpro a été purifié par chromatographie sur métal immobilisé (IMAC) à l'aide d'une colonne HisTrap FF de 5 ml (GE Healthcare). Après lavage de la colonne avec le tampon A (Tris 20 mM pH 7,8, NaCl 150 mM, Imidazole 25 mM), la protéine a été éluée avec le tampon A additionné d'imidazole 250 mM. L'échantillon a été échangé avec un tampon à l'aide d'une colonne de dessalage HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) équilibrée avec le tampon A. Pour éliminer l'étiquette 6xHis, 2 mg de protéase TEV et 4 mM de DTT ont été ajoutés à l'échantillon et incubés pendant une nuit à 4 ° C. Le lendemain, la protéine non clivée et le TEV ont été éliminés par une deuxième étape d'IMAC dans le tampon A. La protéine a ensuite été purifiée par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) à l'aide d'une colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare) équilibrée avec du gel tampon de filtration (Tris 20 mM pH 7,8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Le profil SEC de cet échantillon a montré plusieurs pics se chevauchant d'états oligomères mixtes de Mpro, comme décrit précédemment6. Les pics avec un temps de rétention plus élevé sont principalement composés (échantillon 1), tandis que les pics avec un temps de rétention inférieur sont principalement composés de tétramères (échantillon 2). La pureté des protéines a été analysée par SDS-PAGE et quantifiée à l'aide du coefficient d'extinction théorique de 32 890 M-1.cm-1 39. Des fractions fraîchement purifiées des deux pics ont été aliquotées à 10 mg.mL-1 et immédiatement congelées dans de l'azote liquide.

Pour la préparation de la grille, des échantillons C145S Mpro fraîchement purifiés du pic tétramérique de SEC (échantillon 2) ont été décongelés dans de la glace, centrifugés et dilués dans un tampon de filtration sur gel. Ensuite, 3 µL de 0,25 mg.ml-1 d'échantillons ont été appliqués sur une grille Quantifoil 300 mesh Cu R2/2 à décharge luminescente. La grille a été buvardée à l'aide de Vitrobot (FEI) pendant 2,5 s avec une force de buvardage 1 à une humidité de 100 % et à 4 °C avant de plonger la congélation dans de l'éthane liquide.

Les données ont été recueillies sur Titan Krios fonctionnant à 300 kV à l'aide d'un détecteur K3 en mode super-résolution compté avec une largeur de fente de 20 eV à un grossissement nominal de 130k x correspondant à une taille de pixel calibrée de 0,653 Å au niveau de l'échantillon. Les films ont été enregistrés pendant 1 seconde à un débit de dose de 18,5 e-/px/s et fractionnés en 43 images. L'acquisition des données a été effectuée à l'aide de ThermoFisher Scientific EPU 2.12 avec une plage de défocalisation de -0,5 à -2,5 µm.

Pour la détermination de la structure à haute résolution, les 13 770 films à super résolution collectés à Titan ont été pondérés en fonction de la dose, alignés et regroupés deux fois à l'aide de MotionCor240,41 implémenté dans RELION v3.141, ce qui a donné un pixel physique de 0,653 Å. La fonction de transfert de contraste (CTF) des micrographies résultantes a été estimée à l'aide de CTFFIND-v4.142.

1 956 496 particules ont été prélevées à l'aide de SPHIRE-crYOLO43 et échantillonnées par un facteur de 3, extraites avec une taille de boîte de 72 px. Les particules ont été filtrées et triées avec 3 cycles de classification 2D. 569 725 bonnes particules ont été sélectionnées pour le modèle 3D De novo. Les particules ont été réextraites avec une résolution complète. Les particules ont ensuite été filtrées et triées avec une classification 3D. Les particules de la meilleure classe 3D ont été sélectionnées pour le raffinement 3D et le polissage bayésien dans Relion v3.144.

Le volume Refine3D et les 227 534 particules brillantes ont ensuite été importés dans cryoSPARC v3.2.0 pour raffinement45. Pour la structure déposée, la carte a été initialement affinée à l'aide de l'algorithme de raffinement homogène avec 1 passage final supplémentaire, une résolution passe-bas initiale de 7 Å et une symétrie appliquée C2, ce qui a donné une carte affinée avec une corrélation de coquille de Fourier standard (gsFSC) de 3,75 Å46. La carte résultante a été utilisée pour le raffinement non uniforme47 avec 1 passe finale supplémentaire, une résolution passe-bas initiale de 8 Å, une symétrie appliquée C2, une optimisation de défocalisation par particule et une optimisation CTF par groupe, résultant en une carte affinée avec gsFSC de 3,6 Å. La carte résultante a ensuite été affinée à l'aide de l'algorithme de raffinement local avec une symétrie imposée C2, ce qui a donné une carte avec gsFSC de 3, 5 Å. Le même protocole a également été testé avec la symétrie C1, résultant en une carte presque identique avec gsFSC de 3,76 Å. Par conséquent, la carte C2 a été utilisée pour une modélisation et un raffinement plus poussés. La résolution de la carte a été calculée à l'aide de la résolution locale cryoSPARC et du serveur de traitement 3DFSC48. Les statistiques de la collecte des données, du traitement et de l'affinement du modèle pour le C2 sont disponibles dans le tableau 1. Le schéma des étapes de traitement des données est disponible dans la figure 2.

L'ancrage initial du modèle dans la carte a été effectué à l'aide de PDB 7N6N et de la carte affinée de cryoSPARC à l'aide de UCSF ChimeraX v1.2.549. Pour affiner et améliorer la visualisation de la carte haute résolution, nous avons utilisé phenix auto-sharpen50. La construction et le raffinement du modèle ont été réalisés avec Phenix Real Space Refinement51 et Coot52, et la validation a été réalisée avec MolProbity53. Les figures ont été préparées en utilisant PyMOL et ChimeraX v1.2.5. Les statistiques de raffinement du modèle sont disponibles dans le tableau 1.

Pour analyser la variabilité des particules SARS-CoV-2 Mpro C145S, nous avons utilisé l'outil d'analyse de variabilité 3D (3DVA) disponible dans cryoSPARC v3.2.054. Pour cela, les 569 725 particules de taille réelle utilisées lors de la classification 3D du traitement des données cryo-EM (dans Relion) ont été importées dans cryoSPARC v3.2.0. Ces particules et le volume Refine3D ont été incorporés dans un cycle de raffinement homogène sans symétrie. Ensuite, les particules et le masque ont été utilisés pour calculer 4 vecteurs propres de la matrice de covariance de la distribution des données en utilisant 3DVA54, avec une résolution filtrée à 5 Å. Les séries de modèles ont été générées à l'aide de l'outil d'affichage 3DVA. Les images ont été générées avec ChimeraX v1.2.5.

La chromatographie en phase inversée a été réalisée en ligne avant la spectrométrie de masse à l'aide d'un système HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies inc. - Palo Alto, Californie, États-Unis). Un échantillon de C145S fraîchement préparé contenant des pics tétramères (échantillon 2) a été dilué à 20 µg/ml dans de l'acide formique à 0,1 %, et cinquante µl ont été injectés sur une colonne de garde Zorbax 5 µm 2,1 mm × 12,5 mm 300SB-C3 logée dans un four à colonne réglé à 40 oC. Le système de solvant utilisé consistait en 0,1 % d'acide formique dans de l'eau de qualité LC-MS (Millipore, solvant A) et 0,1 % d'acide formique dans du méthanol (qualité LC-MS, Chromasolve, solvant B). La chromatographie a été réalisée comme suit : les conditions initiales étaient de 90 % A et 10 % B et un débit de 1,0 ml/min. Après 15 s à 10 % B, un gradient linéaire en deux étapes de 10 % B à 80 % B a été appliqué, en 45 s puis de 80 % B à 95 % B en 3 s. L'élution s'est ensuite déroulée de manière isocratique à 95 % de B pendant 1 min 12 s, suivie d'un équilibrage aux conditions initiales pendant 45 s supplémentaires. La masse intacte des protéines a été déterminée à l'aide d'un spectromètre de masse à temps de vol orthogonal à ionisation par électrospray MSD-ToF (Agilent Technologies Inc. - Palo Alto, Californie, États-Unis). L'instrument a été configuré avec la source ESI standard et fonctionnait en mode ions positifs. La source d'ions fonctionnait avec la tension capillaire à 4000 V, la pression du nébuliseur à 60 psig, le gaz de séchage à 350°C et le débit de gaz de séchage à 12 L/min. Les tensions optiques ioniques de l'instrument étaient les suivantes : fragmenteur 250 V, écrémeur 60 V et octopôle RF 250 V.

Pour la spectrométrie de masse native, un échantillon de l'échantillon 2 fraîchement préparé a été maintenu sur de la glace et un tampon échangé dans 75 µl d'acétate d'ammonium 50 mM pH 7,5 par 3 cycles de filtration sur gel à l'aide de colonnes de centrifugation BioGel P6 (Biorad) conformément aux instructions du fabricant. Les spectres de masse ont été acquis à l'aide d'un Agilent 6530 QTOF fonctionnant en mode ions positifs 1 GHz à l'aide d'une source ESI standard. Les échantillons ont été introduits via une pompe à seringue à un débit de 6 µl/min. La source d'ions fonctionnait avec la tension capillaire à 3500 V, la pression du nébuliseur à 17 psig, le gaz de séchage à 325°C et le débit de gaz de séchage à 5 L/min. Les tensions optiques ioniques de l'instrument étaient les suivantes : fragmenteur 430 V, écumeur 65 V et octopôle RF 750 V. Cette même configuration a été utilisée pour décrire la forme native tétramérique d'E. coli LacZ (masse théorique de 465 932 Da), avec une masse repliée observée. de 466 092 Da pour le tétramère55.

En solution, les états oligomères des échantillons purifiés ont été évalués par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (SEC-MALS). Tous les dosages ont été effectués dans un tampon courant composé de Tris-HCl 20 mM pH 7,8, NaCl 100 mM et DTT 1 mM, comme décrit précédemment6. Pour cela, un échantillon de 50 µL de chaque oligomère Mpro C145S à une concentration de 50 µM a été injecté dans un système HPLC Waters 600 (Waters) couplé en ligne à un détecteur UV, un appareil de diffusion de lumière multi-angle miniDAWN TREOS (Wyatt Technology ), une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) avec un débit de 0,5 mL/min, et un détecteur d'indice de réfraction Optilab T-rEX (Wyatt Technology). Les détecteurs à diffusion de lumière ont été normalisés avec de l'albumine de sérum bovin (Sigma-Aldrich). Les données ont été collectées et analysées avec le logiciel intégré ASTRA 7, fourni par Wyatt.

Les échantillons analysés contenaient 100 µg de monomères ou de tétramères C145S Mpro qui ont été incubés avec 1 % de DMSO (témoin) ou un ligand pendant 0 h, 24 h ou 48 h. L'inhibiteur non covalent MAT-POS-e194df51-1, obtenu auprès du Moonshot COVID Consortium, a été testé dans le rapport inhibiteur:protéine de 4:1 et 0,4:1, et incubé pendant 0 h, 24 h ou 48 h d'incubation avec chacun goûter. L'inhibiteur covalent nirmatrelvir a été testé à une concentration de rapport inhibiteur:protéine de 4:1 et incubé pendant 0 h, 24 h ou 48 h. Compte tenu du manque de résolution suffisante des méthodes, les pics de trimères et de tétramères ont été additionnés et traités comme des tétramères. Toutes les données générées sont disponibles sur la Fig. 3 supplémentaire.

Des échantillons de monomères de C145S Mpro (échantillon 1) à 5 mg/mL ont été incubés avec du nirmatrelvir dans un rapport protéine/composé de 1:5 pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, des plaques de cristallisation en gouttes assises ont été installées en utilisant dans des conditions 0,1 M MES pH 6,7, 5 % DMSO, 8 % PEG 4000 à 20 °C. Les cristaux ont été cryoprotégés avec 30 % de PEG 400 et les données ont été recueillies sur la ligne de lumière MANACA (SIRIUS). Les données ont été traitées avec XDS via Autoproc56,57. Les données ont été mises à l'échelle en utilisant Aimless via CCP458, et le remplacement moléculaire a été effectué avec Phaser59, en utilisant PDB 7MBG comme modèle. Les statistiques de collecte de données sont disponibles dans le tableau 2. Les données ont été modélisées avec Coot et affinées avec Acedrg et Refmac52,60,61,62,63. Les figures ont été réalisées avec ChimeraX, Pymol et BioRender.com. La densité électronique de cette structure est visible sur la Fig. 7 supplémentaire.

Pour une expérience de confirmation utilisant une configuration différente, une spectrométrie de masse native a été réalisée à l'aide d'un UHMR Orbitrap Q-Exactive comme décrit précédemment64. En bref, les solutions d'analyte ont été échangées avec un tampon dans de l'acétate d'ammonium 200 mM pH 7, 4 (Sigma Aldrich) en utilisant des colonnes de dessalement Zeba micro spin (7 kDa MWCO, Pierce). Un échantillon contenant 1 à 3 µL d'analyte (dans de l'acétate d'ammonium 200 mM) a été chargé dans des capillaires en verre recouverts d'or préparés en interne et tirés à environ 1 µm. Le capillaire était polarisé de 1,0 à 1,2 kV par rapport au capillaire métallique chauffé (100 ° C) pour générer des ions positifs par ionisation par nanoélectrospray. Le spectromètre de masse a été utilisé en mode ions positifs en utilisant les réglages recommandés par les fabricants pour la détection "faible m/z". Les paramètres suivants ont été ajustés manuellement : potentiel de piégeage en source : 20 – 50 V, 4 ms ; Potentiel HCD : 1 – 10 V ; réglage de la pression : 8,5. Les spectres de masse natifs ont été visualisés dans QualBrowser (Thermo Fisher Scientific) et OriginPro 2021 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Les spectres M/z ici et de l'ESI-TOF natif ont été analysés à l'aide de Masshunter B.07.00 (Agilent) ; ESIprot65 et à l'aide d'une table d'ions. Les états de charge ont été attribués manuellement. Les résultats de cette analyse sont disponibles dans la Fig. 6 supplémentaire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données associées à cette étude sont accessibles au public. Tous les films collectés et les particules polies utilisées pour la détermination de la structure finale sont disponibles à Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) sous le code EMPIAR-10810. Les cartes Cryo-EM et les modèles structurels sont disponibles à la Protein Data Bank (PDB) sous le code 8EY2 et à la Electron Microscopy Data Bank (EMDB) sous le code EMD-28666, et le modèle de rayons X est disponible sous le code PDB 8EYJ. Les structures utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données PDB sous les codes 7N5Z, 7KPH, 7N6N, 7K3T et 7DVP. Un fichier de données source est fourni avec cet article pour tous les SEC-MALS et la spectroscopie de masse native. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Les auteurs reconnaissent Diamond Light Source pour l'accès et le soutien des installations de cryo-EM au Centre national britannique de bio-imagerie électronique (eBIC) par le biais des propositions BI27083 et NT29349, financées par le Wellcome Trust, le MRC et le BBSRC. Les auteurs reconnaissent le consortium COVID Moonshot pour avoir fourni le composé et le professeur Carlos Alberto Montanari pour avoir aimablement fourni le Nirmatrelvir. ASG remercie Andressa Patricia Alves Pinto pour son soutien au SEC-MALS. Ce projet a été financé par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Projet 88887.516153/2020-00, ASG) et Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP projets 2013/07600-3, 2015/16811-3 et 2016/19712-9, GO). Ce travail a reçu le soutien de l'entreprise commune EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 (subvention EUbOPEN n° 875510, RC). Cette recherche a utilisé les installations du SIRIUS, qui fait partie du Centre brésilien de recherche sur l'énergie et les matériaux (CNPEM), une organisation privée à but non lucratif sous la tutelle du ministère brésilien des Sciences, de la Technologie et des Innovations (MCTI). Le personnel de la ligne de lumière MANACA est reconnu pour son aide lors des expériences de la proposition 20220605. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue en partie par le NIAID de l'Institut national de la santé sous le numéro de prix U19AI171399. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l'Institut national de la santé. La recherche au laboratoire Robinson est financée par une subvention du programme du Medical Research Council (MRC) (MR/V028839/1). Cette recherche a également été financée en partie par le Wellcome Trust, Grant No. 221795/Z/20/Z. TJE est chercheur junior au Linacre College et a été soutenu par une bourse internationale Newton de la Royal Society. TJE et CVR sont reconnaissants du généreux soutien apporté par le fonds de réponse à la recherche COVID-19 de l'Université d'Oxford et ses donateurs (BRD00230).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Gabriela Dias Noske, Yun Song.

Une liste complète des membres et de leurs affiliations apparaît dans les informations supplémentaires.

Institut de physique de Sao Carlos, Université de Sao Paulo, Av. Joao Dagnone, 1100 - Jardim Santa Angelina, São Carlos, 13563-120, Brésil

Gabriela Dias Noske, Rafaela Sachetto Fernandes, Glaucius Oliva et André Schutzer Godoy

Centre de bio-imagerie électronique, Diamond Light Source Ltd., Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, OX11 0QX, Royaume-Uni

Yun Song & C.David Owen

Centre de découverte des médicaments, Université d'Oxford, OX1 3QU, Oxford, Royaume-Uni

Rod Chalk, Haitem Elmassoudi & Lizbé Koekemoer

Laboratoire de chimie physique et théorique, Département de chimie, Université d'Oxford, South Parks Road, OX1 3TA, Oxford, Royaume-Uni

Tarick J. El-Baba et Carol V. Robinson

L'Institut Kavli pour la découverte des nanosciences, Dorothy Crowfoot Hodgkin Building, South Parks Road, OX1 3QU, Oxford, Royaume-Uni

Tarick J. El-Baba et Carol V. Robinson

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ASG a conçu ce projet. GDN a réalisé des expériences biochimiques et biophysiques. Grilles préparées par YS et collecte de données. ASG et YS ont traité les données cryo-EM. ASG et GDN ont effectué la modélisation et l'analyse. LK, HE, RC, THE et CVR ont réalisé des expériences MS. ASG a écrit et conçu ce manuscrit. ASG, RSF, YS, CDO et GO ont révisé ce manuscrit.

Correspondance à André Schutzer Godoy.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Jeffrey Agar, Stephen Harding et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Noske, GD, Song, Y., Fernandes, RS et al. Un instantané en solution du processus de maturation et de l'inhibition de la principale protéase du SRAS-COV-2. Nat Commun 14, 1545 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

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Reçu : 01 août 2022

Accepté : 28 février 2023

Publié: 20 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

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