Indoléthylamine N - Stockage cryogénique Chengdu Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 280 (2023) Citer cet article

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L'indoléthylamine N-méthyltransférase (INMT) est une enzyme de transméthylation qui utilise le donneur de méthyle S-adénosyl-L-méthionine pour transférer les groupes méthyle aux groupes amino des composés accepteurs à petites molécules. L'INMT est surtout connue pour son rôle dans la biosynthèse de la N,N-diméthyltryptamine (DMT), un composé psychédélique présent dans le cerveau des mammifères et d'autres tissus. Chez les mammifères, on pense que la biosynthèse de la DMT se produit via la double méthylation de la tryptamine, où l'INMT catalyse d'abord la biosynthèse de la N-méthyltryptamine (NMT) puis de la DMT. Cependant, on ne sait pas si l'INMT est nécessaire à la biosynthèse du DMT endogène. Pour tester cela, nous avons généré un nouveau modèle de rat INMT-knockout et étudié la méthylation de la tryptamine à l'aide de dosages enzymatiques radiométriques, d'une chromatographie en couche mince et d'une spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide ultra-haute performance. Nous avons également étudié la méthylation de la tryptamine chez le rat recombinant, le lapin et l'INMT humain. Nous rapportons que les tissus cérébraux et pulmonaires des rats de type sauvage et knock-out INMT présentent des niveaux égaux d'activité tryptamine-dépendante, mais que les produits enzymatiques ne sont ni NMT ni DMT. De plus, l'INMT de rat n'était pas suffisante pour la biosynthèse de NMT ou de DMT. Ces résultats suggèrent une voie enzymatique alternative pour la biosynthèse du DMT chez le rat. Ce travail motive l'étude de nouvelles voies pour la biosynthèse endogène du DMT chez les mammifères.

L'indoléthylamine N-méthyltransférase (INMT) est une enzyme de transméthylation qui catalyse le transfert des groupes méthyle du cofacteur S-adénosyl-L-méthionine (SAM) aux groupes amino des substrats accepteurs de petites molécules1. L'enzyme a une large spécificité de substrat pour plusieurs amines endogènes et d'autres petites molécules, la tryptamine et la N-méthyltryptamine (NMT) étant généralement considérées comme les principaux substrats de l'enzyme2,3. Dans une réaction en deux étapes qui utilise SAM comme donneur de méthyle, l'INMT catalyse le transfert d'un groupe méthyle sur la chaîne latérale aminée de la tryptamine pour former d'abord la NMT, puis la N, N-diméthyltryptamine (DMT) (Fig. 1). Cette voie a été décrite pour la première fois en 1961 par Axelrod4 qui a utilisé un dosage enzymatique radiométrique et une chromatographie sur couche mince pour démontrer que des extraits de poumon de lapin incubés avec de la tryptamine et du C14-SAM produisaient du C14-NMT et du C14-DMT. Cette étude a été l'une des premières à montrer que des métabolites « psychotomimétiques » pouvaient être formés par voie enzymatique à partir de composés naturels.

La voie de biosynthèse du DMT chez les mammifères. On pense que la méthylation de la tryptamine pour former la N,N-diméthyltryptamine se produit via une réaction en deux étapes catalysée par l'enzyme indoléthylamine-N-méthyltransférase (INMT), avec la N-méthyltryptamine (NMT) comme intermédiaire. Le cofacteur S-adénosyl-L-méthionine (SAM) sert de donneur de méthyle, avec la S-adénosyl-L-homocystéine (SAH) comme sous-produit de ce transfert de méthyle.

L'expression de l'ARNm de l'INMT a été étudiée chez plusieurs espèces de mammifères et a été signalée dans le cerveau, le foie et les poumons du lapin1, plusieurs tissus humains, notamment le cœur, les poumons, le foie et la glande surrénale5, ainsi que dans le cerveau, le foie, les poumons, les reins, le cœur. , et glande surrénale de rat6. De plus, l'expression de la protéine INMT a été démontrée dans les tissus de la glande pinéale, de la moelle épinière et de la rétine du macaque rhésus7. Les extraits de tissus pulmonaires, notamment de lapin, ont historiquement montré une expression plus élevée de l'INMT et une plus grande activité de méthylation vis-à-vis de la tryptamine et de la NMT, par rapport aux autres tissus1,8,9. En conséquence, l'INMT de lapin a été le premier INMT à être cloné et caractérisé, l'INMT humain suivant peu après1,5. Lorsqu'elles sont exprimées dans des cellules COS-1, les deux protéines recombinantes ont démontré une capacité suffisante pour la méthylation de la tryptamine avec des valeurs apparentes de Km (mM) de (moyenne ± SEM) 0,27 ± 0,05 et 2,92 ± 0,07 respectivement1,5.

Bien que les rôles endogènes de l'INMT ne soient pas entièrement compris, l'enzyme est peut-être mieux connue pour sa fonction de méthylation de la tryptamine endogène pour former le composé psychédélique doublement méthylé DMT10. La DMT a une similitude structurelle avec le neurotransmetteur sérotonine (5-HT), elle produit des effets psychédéliques lorsqu'elle est administrée à l'homme11 et elle est présente de manière endogène dans une variété d'espèces végétales ainsi que dans les tissus de mammifères et les fluides corporels12. La présence de DMT endogène a été confirmée pour la première fois chez l'homme en 1965 par des analyses de sang et d'urine13 et a ensuite été confirmée dans le sang, l'urine et le liquide céphalo-rachidien d'humains avec une variété de techniques analytiques sophistiquées, y compris la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la haute performance la chromatographie liquide (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse (MS) (voir référence14 pour un examen approfondi). Cependant, l'échantillonnage in vivo de DMT dans le cerveau a été limité aux études sur les rongeurs, les rats étant l'espèce la plus largement étudiée à cette fin. Plusieurs rapports ont confirmé la présence de DMT endogène dans le cerveau de rat et d'autres tissus. Saavedra et Axelrod ont effectué des injections intracisternales de C14-tryptamine chez des rats et ont démontré la récupération dans tout le cerveau de C14-NMT et de C14-DMT par chromatographie en couche mince avec plusieurs systèmes de solvants15. Beaton et Morris ont détecté et quantifié la DMT à partir d'extraits de cerveau entier de rats non traités à différents stades de développement à l'aide de GC-MS16. Kärkkäinen et al. des rats prétraités avec un inhibiteur de la monoamine oxydase (IMAO) et ont trouvé du DMT présent dans les tissus rénaux, pulmonaires, hépatiques et cérébraux à l'aide de la spectrométrie de masse en tandem HPLC (MS/MS)17. Barker et al. analysé des échantillons de perfusat collectés par microdialyse dans le cortex occipital de rats non traités se comportant librement et confirmé la présence de DMT à l'aide de LC-MS/MS18. Enfin, Dean et al. ont utilisé la CLHP avec détection de fluorescence pour quantifier la DMT dans des échantillons de perfusat prélevés dans le cortex occipital de rats non traités se comportant librement et ont montré que les niveaux de DMT endogène variaient de 0,05 à 2,2 nM6.

Certains aspects de la biochimie INMT ont empêché une compréhension claire de ses fonctions et de son rôle dans la méthylation de la tryptamine. Cela est en partie dû au fait que de nombreuses études antérieures examinant la fonction INMT reposaient sur des essais ex vivo utilisant des extraits de protéines brutes ou partiellement purifiées. Ces techniques sont utiles pour comprendre une large activité enzymatique des tissus mais sont insuffisantes pour caractériser l'activité d'une seule enzyme. Un indicateur de cette limitation est la promiscuité rapportée de l'activité enzymatique des extraits protéiques. En effet, plusieurs études utilisant des extraits de diverses sources tissulaires ont rapporté que les enzymes de ces tissus interagissent avec jusqu'à trois douzaines de substrats distincts, y compris des composés endogènes et des xénobiotiques2,3,19. Ces découvertes étaient souvent caractérisées de manière générale comme résultant de "l'activité INMT", mais les méthodologies étaient insuffisantes pour cette caractérisation. Un autre indicateur des limites de ces techniques est que les extraits protéiques semblent présenter des niveaux incohérents d'activité et d'affinité envers les substrats lorsque les conditions de test varient ou lorsqu'ils proviennent de différents tissus au sein de la même espèce10. Par exemple, en utilisant des enzymes d'extraits bruts de poumon de lapin, Axelrod a identifié la 5-HT comme le substrat préféré, la tryptamine et la NMT montrant respectivement 81 % et 39 % de l'activité de la 5-HT3. Cependant, d'autres études utilisant une enzyme de la même source ont révélé que la NMT était le substrat préféré avec une valeur de Km de 50 µM, suivie de la tryptamine avec un Km de 330 µM8,9,20. L'activité enzymatique dosée à partir d'extrait brut de cerveau de poulet a montré que la 5-HT était le substrat préféré, la tryptamine et la NMT montrant une activité relative de 60 % et 47 %, respectivement, et une étude avec des extraits de cerveau humain a montré que la tryptamine était le substrat préféré (111 % ), par rapport à la 5-HT (100 %) et à la NMT (55 %)2. Enfin, l'activité enzymatique des extraits bruts de cerveau de rat a montré des incohérences supplémentaires, la tryptamine étant le substrat préféré (Km = 27,8 µM) suivie de la NMT (Km = 36,8 µM)22.

Une approche plus directe pour étudier l'activité d'une enzyme spécifique d'intérêt est l'utilisation de protéines recombinantes purifiées. Thompson et ses collègues ont été les premiers à adopter cette approche, car ils ont cloné, exprimé et caractérisé à la fois l'INMT de lapin et d'humain, confirmant que ces deux enzymes méthylent effectivement la tryptamine1,5. Cependant, malgré le fait que les rats aient servi d'espèce modèle pour la détection endogène du DMT dans le cerveau, aucune étude à ce jour n'a tenté de caractériser l'activité de l'INMT de rat recombinant ou d'étudier l'INMT de rat à l'aide d'approches transgéniques modernes.

Pour mieux comprendre le rôle que joue l'INMT dans la biosynthèse du DMT endogène, nous avons utilisé CRISPR/Cas9 pour développer un nouveau modèle de rat déficient en INMT. Les rats ont été choisis parce qu'ils ont été l'espèce modèle pour la détection in vivo du DMT à ce jour. Étant donné que l'une des fonctions principales de l'INMT a longtemps été supposée être la méthylation de la tryptamine pour former la NMT et la DMT, nous avons émis l'hypothèse que les tissus de rats déficients en INMT seraient dépourvus de ces fonctions. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé des paires de compagnons de portée provenant de croisements INMT + / - pour comparer l'activité de méthylation de la tryptamine dans les tissus cérébraux et pulmonaires entre les rats INMT + / + (WT) et INMT - / - (KO). Avant cette étude, l'étude de l'INMT recombinante était limitée aux INMT de lapin et d'humain, nous avons donc également comparé l'activité de méthylation de la tryptamine de l'INMT recombinante de rat, de lapin et d'humain exprimée dans E. coli. Pour étudier l'activité enzymatique, y compris l'identification et la quantification des produits de réaction des dosages enzymatiques, nous avons utilisé une batterie de techniques expérimentales et d'outils analytiques, notamment des dosages enzymatiques radiométriques avec comptage par scintillation, chromatographie en couche mince avec imagerie au phosphore et liquide ultra-haute performance. chromatographie spectrométrie de masse en tandem (uHPLC-MS/MS).

À l'aide de CRISPR/Cas9, une délétion de 2 nucléotides a été introduite dans l'exon 1 du gène INMT du rat (Fig. 2a), entraînant une mutation par décalage de cadre (Fig. 2b) et l'absence d'expression de la protéine INMT chez le rat (Fig. 2c) . La présence ou l'absence d'expression d'INMT chez les rats a été confirmée avec des produits de PCR à partir de coupures de queue et des transferts Western à l'aide d'homogénats de tissu pulmonaire. La suppression de l'INMT n'a pas entraîné d'anomalies comportementales ou physiologiques manifestes, et les rats étaient viables sur le plan de la reproduction. Pour déterminer l'impact de la suppression de l'INMT sur l'activité enzymatique dépendante de la tryptamine, nous avons effectué des dosages enzymatiques radiométriques en utilisant des tissus cérébraux et pulmonaires de rats WT et KO ; des extraits de tissu pulmonaire de lapin ont été utilisés comme contrôle positif (Fig. 2d). Ces tests très sensibles reposent sur le transfert d'un groupe méthyle radiomarqué (C14) de C14-SAM à un substrat, où l'activité est mesurée par comptage à scintillation liquide. Les données indiquent que la suppression de l'INMT de rat n'a eu aucun impact détectable sur la capacité des extraits de cerveau ou de poumon à méthyler la tryptamine.

La méthylation enzymatique de la tryptamine ne diffère pas entre les rats WT et INMT-KO (a) La structure génique de l'INMT de rat avec les exons représentés dans des boîtes noires. L'emplacement et la séquence de l'ARN guide INMT (ARNg) sont indiqués par un triangle rouge. (b) La suppression de 2 paires de bases responsable de la génération du KO est indiquée sous la séquence de type sauvage (WT) avec l'emplacement de l'ARNg souligné. ( c ) Western blot montrant la présence d'INMT (bandes vertes) dans les tissus pulmonaires de rat WT, mais pas KO. L'image originale comprenant toutes les voies du marqueur de poids moléculaire est incluse dans la figure supplémentaire S1. ( d ) Dosages enzymatiques radiométriques avec des extraits de tissus de poumon de lapin, ainsi que de cerveau de rat et de poumon de rat provenant de rats WT et INMT-KO. Chaque point représente la moyenne de 3 expériences en triple d'un animal individuel pour les lapins (n = 3) et les rats (n = 6) pour chaque génotype. Les graphiques montrent des moyennes avec des barres d'erreur indiquant les écarts-types. CPM : compte par minute. Des extraits de tissu pulmonaire de lapin (n = 3) ont montré une activité dépendante de la tryptamine > 20 fois supérieure à celle des tissus de rat (activité spécifique moyenne [SA] = 322,2 ± 8,81, intervalle de confiance [IC] à 95 % de la moyenne = 300,3–344,0). L'activité dépendante de la tryptamine ne différait pas entre les rats WT et KO dans le cerveau (t = 0,30, différence moyenne = − 0,36, IC à 95 % = − 3,05–2,33, p = 0,77) ou les tissus pulmonaires (t = 0,52, différence moyenne = − 0,25, IC à 95 % = − 1,33–0,84, p = 0,62). Dans le cerveau, l'AS moyen était de 14,68 ± 2,34, IC à 95 % de la moyenne = 12,22–17,13 en WT, et 14,32 ± 1,76, IC à 95 % de la moyenne = 12,47–16,16 en KO. Dans les poumons, l'AS moyen était de 6,36 ± 0,66, IC à 95 % de la moyenne = 5,66 à 7,05 en WT, et 6,11 ± 0,96, IC à 95 % de la moyenne = 5,10 à 7,12 en KO. L'activité dépendante de la tryptamine était significativement plus élevée dans les tissus cérébraux que dans les poumons (t = 8,38, différence moyenne = 8,32, IC à 95 % = 5,87–10,77, p = 0,0002 pour WT et t = 10,04, différence moyenne = 8,21, IC à 95 % = 6.31–10.11, p < 0,0001 pour KO).

Pour caractériser l'activité de méthylation de la tryptamine à partir des tissus cérébraux et pulmonaires des rats WT et KO, la chromatographie en couche mince a d'abord été utilisée pour évaluer les produits de réaction, et l'uHPLC-MS/MS a été mise en œuvre pour fournir une validation et une quantification supplémentaires. Avec la chromatographie sur couche mince, les étalons de tryptamine, NMT et DMT ont produit des valeurs de facteur de retardement (RF) de 0, 65, 0, 55 et 0, 47, respectivement (Fig. 3, à gauche). Des extraits de protéines de fusion glutathion-S-transférase-INMT de lapin (GST-INMT) exprimées dans E. coli (contrôle positif) ont produit deux taches distinctes qui étaient isographiques avec NMT (RF = 0, 53) et DMT (RF = 0, 46). Les tissus de rat, y compris le cerveau et les poumons des rats WT et KO, n'ont pas produit de taches isographiques avec NMT ou DMT, mais ont produit deux taches distinctes avec des valeurs RF de 0, 67 (en haut) et 0, 37 (en bas). Toutes les conditions où la tryptamine a été omise n'ont montré aucune activité de méthylation détectable.

Les tissus cérébraux et pulmonaires des rats WT et KO produisent des produits qui ne sont pas isographiques avec NMT ou DMT. Balayage d'imagerie au phosphore de produits de dosage enzymatique radiométrique à l'aide d'extraits de tissus cérébraux et pulmonaires de rats WT et KO après séparation sur des plaques de gel de silice à l'aide d'une phase mobile de N-butanol:acide acétique:eau (12:3:5). Un mélange standard (Std) contenant de la tryptamine, du NMT et du DMT a été clairement séparé en utilisant ces méthodes de chromatographie (piste la plus à gauche). L'analyse d'imagerie au phosphore non recadrée et non traitée du graphique est incluse dans la figure supplémentaire S2.

Pour l'analyse uHPLC-MS/MS des produits de réaction des analyses d'extrait de tissu (tableau 1), la tryptamine a été omise du tissu correspondant pour chaque condition afin de servir de contrôle de fond pour les niveaux de NMT.

Des extraits de tissu pulmonaire de lapin ont été utilisés comme contrôle positif et les résultats indiquent que ces extraits ont produit du NMT à un niveau de près de 300 fois celui du niveau de fond et du DMT à un niveau de (moyenne ± écart type) 0, 57 ± 0, 18 nM. Cette activité dépendait de l'addition de tryptamine au mélange réactionnel. Cependant, les tissus cérébraux et pulmonaires des rats WT et KO n'ont pas montré de production dépendante de la tryptamine de NMT ou de DMT. Ces résultats sont cohérents avec les résultats de la chromatographie sur couche mince et confirment que dans ces conditions d'essai, la NMT et la DMT ne sont pas produites par des enzymes présentes dans les tissus cérébraux ou pulmonaires du rat.

Des extraits de cellules d'E. coli exprimant des protéines de fusion GST-INMT recombinantes de rat, de lapin et d'humain ont été utilisés pour la quantification radiométrique de l'activité dépendante de la tryptamine de chacune de ces enzymes (Fig. 4). Ces données démontrent une activité dépendante de la tryptamine robuste de l'INMT du lapin et de l'homme et indiquent que l'INMT du rat n'est pas suffisante pour la méthylation de la tryptamine.

L'INMT du rat n'est pas suffisante pour la méthylation de la tryptamine. ( a ) Western blot montrant l'expression de protéines de fusion GST-INMT d'INMT de rat, de lapin et d'humain dans E. coli. La voie de contrôle montre l'expression d'un vecteur GST vide, où INMT est absent. L'image non recadrée de la tache occidentale est incluse dans la figure supplémentaire S3. ( b ) Dosages enzymatiques radiométriques avec des extraits d'E. coli exprimant des protéines recombinantes GST-fusion de rat, de lapin et d'INMT humaine. Les tracés montrent la moyenne de 6 expériences individuelles par condition avec des barres d'erreur indiquant les écarts-types. CPM = compte par minute. Le test a révélé une activité tryptamine-dépendante de l'INMT de lapin (AS moyen = 350,9 ± 23,08, IC à 95 % de la moyenne = 326,7–375,1) et de l'INMT humain (AS moyen = 171,8 ± 12,38, IC à 95 % de la moyenne = 158,8–184,8) . L'activité était significativement plus élevée chez le lapin INMT par rapport à l'INMT humain (t = 16, 75, différence moyenne = 179, 1, IC à 95% = 154, 3–204, p <0, 0001). L'activité de l'INMT chez le rat (AS moyen = 0,64 ± 0,21, IC à 95 % de la moyenne = 0,42 à 0,85) était significativement plus faible (t = 3,68, différence moyenne = − 0,48, IC à 95 % = − 0,77 à − 0,19, p = 0,004 ) que les extraits de GST à vecteur vide (AS moyen = 1,12 ± 0,24, IC à 95 % de la moyenne = 0,86 à 1,37).

Pour exclure la possibilité qu'un facteur inhibiteur dans les extraits d'E. HEK) 293 cellules (Figure supplémentaire S4). Pour déterminer si l'INMT de rat a la capacité de méthyler la NMT, les tests ont été effectués en utilisant des protéines de fusion GST-INMT et la NMT comme substrat, et des résultats similaires ont été observés (Figure supplémentaire S5). L'INMT du rat n'a pas montré d'activité enzymatique vis-à-vis de la NMT, mais les INMT du lapin et de l'homme étaient tous deux très actifs.

La chromatographie en couche mince couplée à l'imagerie au phosphore a été utilisée pour identifier les produits de réaction dépendant de la tryptamine des dosages enzymatiques recombinants radiométriques décrits ci-dessus. Des solutions pures d'étalons de tryptamine, de NMT et de DMT non marquées ont été clairement séparées à l'aide de ce système de solvant (Fig. 5, à gauche).

Le lapin et l'humain, mais pas le rat INMT, méthylate tryptamine pour produire du NMT et du DMT. Balayage par imagerie au phosphore des produits de dosage enzymatique radiométrique à l'aide de protéines de fusion GST-INMT recombinantes après séparation sur des plaques de gel de silice à l'aide d'une phase mobile de N-butanol:acide acétique:eau (12:3:5). Un mélange standard (Std) contenant de la tryptamine, du NMT et du DMT a été clairement séparé en utilisant ces méthodes de chromatographie (piste la plus à gauche). Les normes ont montré des valeurs RF respectives de 0,58, 0,49 et 0,39. L'INMT de lapin, l'INMT humain et le poumon de lapin ont chacun montré deux taches isographiques avec NMT et DMT. Pour le lapin INMT, NMT RF = 0,48 DMT RF = 0,41. Pour l'INMT humain, NMT RF = 0,48 et DMT RF = 0,41. Pour le poumon de lapin (témoin positif), NMT RF = 0,50 et DMT RF = 0,41. Ni les préparations de GST de vecteur vide ni la GST-INMT de rat n'ont montré de produits détectables, ce qui indique un manque d'activité de méthylation. L'analyse d'imagerie au phosphore non recadrée et non traitée du même graphique est incluse dans la figure supplémentaire S6.

Les protéines INMT recombinantes de lapin et d'humain ont montré une activité de méthylation dépendante de la tryptamine robuste, tandis que la protéine INMT recombinante de rat n'avait aucune activité détectable envers la tryptamine.

Lorsque la NMT a été utilisée à la place de la tryptamine comme substrat, des résultats similaires ont été observés (Figure supplémentaire S7): l'INMT du rat ne produisait pas de produits méthylés, mais les INMT du lapin et de l'homme produisaient du DMT comme indiqué par la présence de taches isographiques avec un DMT norme de référence. De plus, toutes les conditions dans lesquelles la tryptamine (Fig. 5) ou la NMT (Figure supplémentaire S7) ont été omises n'ont montré aucune méthylation détectable, confirmant que les réactions dépendent du substrat.

La validation de ces résultats a été réalisée par uHPLC-MS/MS. Pour les études INMT recombinantes, des extraits d'E. coli vecteurs vides transformés par GST incubés avec de la tryptamine et SAM ont servi de témoins de fond, et la valeur NMT de ces tests a été définie comme fond. Ces tests ont montré que la production de NMT et de DMT dépendante de la tryptamine ne se produisait qu'avec l'INMT de lapin et humaine, où l'INMT de lapin montrait une production de NMT > 50 fois supérieure à celle des témoins de fond, et l'INMT humaine > 60 fois supérieure (tableau 2). Contrairement à l'INMT de lapin et d'humain, l'INMT de rat n'a pas montré de production détectable de NMT ou de DMT dépendant de la tryptamine. Les concentrations de DMT produit par voie enzymatique résultant de ces tests étaient (moyenne ± écart type) 0,23 ± 0,03 et 0,12 ± 0,06 pour le lapin et l'INMT humain respectivement.

Lorsque la NMT a été utilisée à la place de la tryptamine comme substrat, la production de DMT n'a été confirmée qu'à partir d'INMT de lapin et d'humain, et l'INMT de rat était inactive (tableau supplémentaire S1). Pour toutes les conditions, l'omission de substrats de tryptamine ou de NMT a entraîné des niveaux indétectables de produits NMT et DMT. En plus de fournir une quantification précise des analytes, ces résultats correspondent étroitement à ceux des dosages enzymatiques radiométriques et fournissent une validation des résultats de la chromatographie en couche mince.

Nous rapportons pour la première fois la génération d'un nouveau modèle de rat transgénique INMT-KO, ainsi qu'une étude multi-espèces complète de l'INMT en relation avec l'activité dépendante de la tryptamine et la biosynthèse de la NMT et de la DMT. De plus, cette étude est la première à étudier l'activité dépendante de la tryptamine de l'INMT de rat recombinant, ce qui est pertinent pour le domaine car le rat est actuellement l'espèce modèle pour la détection in vivo du DMT dans le cerveau. La combinaison de techniques traditionnelles (dosages enzymatiques radiométriques et chromatographie en couche mince) et de techniques modernes (rats INMT-KO développés par CRISPR/Cas9, comparaisons INMT recombinantes multi-espèces et uHPLC-MS/MS) aboutit à une caractérisation informative de la fonction INMT , la méthylation de la tryptamine et la biosynthèse du DMT endogène.

La principale découverte de cette enquête est que l'INMT n'est pas nécessaire pour la méthylation de la tryptamine et la biosynthèse de la NMT et de la DMT dans les tissus cérébraux ou pulmonaires des rats. À l'aide d'un dosage enzymatique radiométrique très sensible, nous montrons que des extraits de tissus cérébraux et pulmonaires de rats WT et KO présentent des niveaux égaux d'activité dépendante de la tryptamine dans ces conditions de dosage. Lors de l'examen de l'INMT recombinante exprimée dans des cellules d'E. coli, nous avons constaté que l'INMT du rat ne présentait pas d'activité dépendante de la tryptamine, tandis que l'INMT du lapin et de l'homme étaient tous deux très actifs. Cela est probablement dû au faible degré d'homologie de séquence de l'INMT entre les espèces. Bien que les séquences de l'INMT du lapin et de l'humain soient presque identiques (89%), l'INMT du rat n'est homologue qu'à 57% avec l'un ou l'autre. Ensemble, ces résultats démontrent que les tissus de rat possèdent une enzyme qui montre une activité de méthylation dépendante de la tryptamine, mais que l'enzyme responsable n'est pas l'INMT.

La chromatographie en couche mince couplée à l'imagerie au phosphore a révélé que les produits méthylés des tissus pulmonaires de lapin, ainsi que l'INMT recombinante de lapin et d'humain étaient isographiques avec NMT et DMT. Cependant, l'INMT de rat n'a entraîné la biosynthèse d'aucun produit méthylé détectable, ce qui indique que l'INMT de rat ne catalyse pas la méthylation de la tryptamine. Fait intéressant, parallèlement aux résultats des tests radiométriques, des extraits de tissus du cerveau et des poumons de rats WT et KO ont montré une activité de méthylation de la tryptamine égale, produisant deux taches distinctes lorsqu'ils sont soumis à une chromatographie sur couche mince. Cependant, aucune de ces taches n'était isographique avec NMT ou DMT. Ces résultats soutiennent la conclusion que l'identité de l'enzyme qui méthyle la tryptamine n'est pas INMT, et montrent en outre que les produits de cette réaction enzymatique non identifiée ne sont ni NMT ni DMT. Enfin, les expériences uHPLC-MS/MS ont répliqué et validé les résultats de la chromatographie en couche mince - le poumon de lapin, ainsi que l'INMT recombinante de lapin et d'humain (mais pas de rat) peuvent produire du NMT et du DMT dans ces conditions d'essai, et des extraits de tissus du cerveau et du poumon des rats WT et KO ne produisent ni NMT ni DMT. Pris ensemble, en conjonction avec le fait que le DMT a été détecté indépendamment dans le cerveau du rat par plusieurs groupes6,15,16,17,18, ces résultats suggèrent qu'une voie de biosynthèse alternative pour le NMT et le DMT est présente dans les tissus cérébraux et pulmonaires de les rats. Il est donc probable qu'il existe une N-méthyltransférase de mammifère distinctive qui peut méthyler la tryptamine pour produire du NMT et du DMT.

Il existe des preuves biochimiques pour soutenir l'existence possible de plusieurs enzymes qui modifient la tryptamine. Le travail pionnier d'Axelrod en 19614 a utilisé des extraits bruts prélevés sur des tissus pulmonaires de lapin pour doser l'activité de méthylation de la tryptamine, une pratique relativement courante dans la méthodologie des dosages enzymatiques. La grande majorité des études INMT au cours des trois décennies suivantes ont utilisé des stratégies similaires avec des extraits de tissus bruts ou partiellement purifiés comme sources de protéines pour les tests dits INMT. En effet, à mesure que des méthodes de purification de protéines plus sophistiquées sont devenues disponibles, des études plus récentes ont noté l'existence probable de protéines distinctives ayant une activité de méthylation de la tryptamine. En utilisant des extraits de poumon de lapin partiellement purifiés, Porta et al. ont décrit deux protéines de méthylation de la tryptamine de type INMT distinctes avec une cinétique enzymatique similaire, mais des points isoélectriques et des optima de pH distincts23. De plus, Ansher et Jakoby ont identifié ce qu'ils ont appelé « méthyltransférase A » et « méthyltransférase B » à partir d'extraits de foie de lapin purifiés19. Ces deux formes d'INMT ont montré une activité de méthylation de la tryptamine et avaient le même poids moléculaire mais différaient par leurs points isoélectriques et leurs interactions de sous-état. Nos résultats motivent des études similaires dans des tissus de rat et d'humain pour déterminer si d'autres enzymes de méthylation de la tryptamine sont présentes.

Il est bien connu que le comportement des enzymes individuelles dans des conditions in vitro dépend fortement d'un certain nombre de variables expérimentales, notamment le pH, la température, la force ionique, la concentration des composants du test, la composition du tampon et les interactions de divers cofacteurs ou composants non directement impliqué dans la réaction24. Il est donc raisonnable de conclure que dans les conditions in vitro actuelles, la méthylation de la tryptamine pour former du NMT et du DMT dans des extraits bruts de cerveau et de poumon de rat n'est pas possible. Au lieu de cela, ces conditions ont favorisé l'activité d'une enzyme alternative, qui a contribué à la production des produits non identifiés illustrés à la Fig. 3. Plusieurs études ont utilisé des approches in vivo pour démontrer la présence de DMT endogène dans le cerveau du rat6,15,17, 18, 25, soulignant l'importance des conditions physiologiques in vivo pour la méthylation de la tryptamine dans les tissus cérébraux du rat. Nous supposons donc qu'une exploration de conditions de test alternatives ou un criblage enzymatique plus approfondi entraînerait la production détectable de NMT et de DMT dans les tissus de rat. Ces études seront essentielles pour mieux comprendre la fonction, la régulation et les voies de biosynthèse du DMT endogène.

L'identité des produits fabriqués à partir d'extraits de cerveau et de poumon de tissus de rat WT et KO est actuellement inconnue, mais des candidats probables pour ces composés peuvent être les β-carbolines et leurs alcaloïdes associés. Les β-carbolines sont une classe abondante de composés qui servent d'IMAO et se caractérisent par leur structure indole tricyclique fusionnée à la pyridine. À ce jour, plus de 500 monomères alcaloïdes tricycliques β-carboline ont été isolés à partir de sources naturelles26. Fait intéressant, la tryptamine est connue depuis longtemps pour servir de réactif dans la biosynthèse de diverses β-carbolines via la réaction de Pictet-Spengler, une réaction chimique entraînant la condensation de la tryptamine et la fermeture du cycle qui en résulte27. Cette réaction peut se produire de manière non enzymatique ou enzymatique via l'enzyme strictosidine synthase28. De plus, il a été démontré que plusieurs alcaloïdes β-carboline sont présents dans les tissus cérébraux de mammifères, y compris des rats29, et d'autres études ont rapporté la formation possible d'alcaloïdes β-carboline en utilisant des dosages similaires à l'étude actuelle30,31. Avec ce mécanisme à l'esprit, il est donc raisonnable d'émettre l'hypothèse que les identités des produits résultant de l'incubation de tissus cérébraux et pulmonaires de rat avec de la tryptamine pourraient bien être des alcaloïdes β-carboline. Indépendamment de l'identité des produits de réaction inconnus, la production enzymatique de ces composés dérivés de la tryptamine est clairement indépendante de l'INMT, indiquant l'existence d'une enzyme alternative qui modifie la tryptamine chez les mammifères. Une enquête sur ces produits et leurs voies de biosynthèse respectives conduira probablement à une compréhension plus approfondie des métabolites de la tryptamine dans la physiologie des mammifères. La disponibilité de rats INMT-KO devrait faciliter une meilleure compréhension de la fonction endogène de cette enzyme chez le rat.

En conclusion, nos résultats confirment que les extraits de tissus pulmonaires de lapin, d'INMT humain et de lapin sont tous capables de méthyler la tryptamine pour former à la fois du NMT et du DMT. Cependant, l'INMT de rat et les extraits de tissus de cerveau et de poumon de rat ne produisent pas de NMT ou de DMT dans les conditions actuellement étudiées. Au contraire, les tissus de rat interagissent avec la tryptamine pour produire des produits alternatifs, et l'INMT n'est pas nécessaire pour cette réaction. Étant donné que la présence in vivo de DMT dans le cerveau du rat est bien établie, ces résultats suggèrent l'existence potentielle d'une voie de biosynthèse alternative pour le DMT dans la physiologie des mammifères.

Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12:12 commençant à 7 heures du matin et ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. L'étude a été approuvée par le Animal Care and Use Committee de l'Université du Michigan à Ann Arbor, et toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et recommandations pertinentes de ce comité. Des rats INMT-KO ont été générés dans un contexte F344 à l'aide de CRISPR/Cas9 au Transgenic Animal Model Core de l'Université du Michigan via une délétion de 2 paires de bases dans l'exon 1 de la séquence codante INMT. Au jour postnatal 21, les ratons ont été sevrés et des sections de queues de 1 mm ont été prélevées dans des tubes stériles pour le génotypage à l'aide d'une procédure standard d'extraction d'ADN, et les rats ont été identifiés comme WT (INMT + / +), KO (INMT −/−) , ou hétérozygote (INMT + /−). Pour les tests enzymatiques comparant les rats WT aux rats KO, des rats hétérozygotes ont été élevés pour produire des portées contenant les deux génotypes, et des compagnons de litière ont été utilisés pour les comparaisons de tests INMT entre les rats WT et KO. Les critères d'exclusion pour les rats ont été définis a priori et comprenaient (1) un génotype hétérozygote et (2) toute anomalie comportementale ou physiologique évidente. Par conséquent, seuls les rats WT et KO ont été utilisés dans l'étude, et tous les rats étaient en bonne santé au moment du sacrifice. Toutes les procédures étaient conformes aux directives recommandées par ARRIVE.

Des INMT de rat (NM_001109022.1), de lapin (NM_001082043.1) et humain (NM_006774.5) ont été générés par PCR en utilisant les séquences d'amorces suivantes : les amorces sens et antisens humaines étaient 5′-AAAAGGATCCATGAAGGGTGGCTTCACTGGG-3′, et 5′-AAAAGAATTCTCAGGGCCCAGGCTTCTTGCG-3′, respectivement. Les amorces sens et antisens de lapin étaient respectivement 5'-AAAAGGATCCATGGAGGGCGGCTTCACGGG-3' et 5'-AAAAGAATTCTCAGGACCCCGGCTTCTTGC-3'. Les amorces sens et antisens de rat étaient respectivement 5'-AAAAGGATCCATGGCAGGCAAGGTATACATG-3' et 5'-AAAAGAATTCTCAGGCACTGGGACCCTTTCG-3'. Chacun des clones a été modifié dans des vecteurs d'expression bactériens pGEX-2TK en utilisant les enzymes de restriction BamH I et EcoR I. Ces vecteurs contenaient des gènes de glutathion-S-transférase (GST) qui servent à augmenter la solubilité et l'expression des INMT recombinantes. Les clones ont été transformés dans BL21 (DE3) (Sigma Aldrich #CMC0015) pour une expression dans E. coli. Les colonies ont été inoculées dans 25 ml d'ampicilline LB à 37 ° C pendant 15 à 18 h. Les cellules ont ensuite été récoltées, culottées, le surnageant a été jeté et les cellules ont été congelées à - 20 ° C avant la lyse cellulaire et la dialyse.

Pour les extraits de cerveau et de poumon, des rats (âgés de 10 semaines) ont été euthanasiés par inhalation de CO2 et décapités. Le cerveau et les poumons entiers ont été rapidement extraits, coupés en dés et immédiatement congelés sur de la neige carbonique dans des tubes de microcentrifugeuse. Des tissus pulmonaires de lapin congelés ont été obtenus auprès de Pel-Freez Biologicals. Les tissus congelés (cerveau ou poumon de rat ou poumon de lapin) et les culots de GST-INMT congelés ont été remis en suspension dans 5 volumes de tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,9) et homogénéisés avec trois salves à 6000 tr/min. Les homogénats ont été centrifugés à 100 000 g pendant 60 min à 4 °C. Les surnageants ont été dialysés pendant une nuit à 4 ° C avec 100 volumes de tampon phosphate de sodium avec 3 changements de tampon toutes les 4 h, en utilisant des kits de dialyse Pur-A-Lyzer Maxi de coupure de poids moléculaire de 12 kDa (Sigma Aldrich). Les concentrations de protéines des surnageants dialysés ont été déterminées via Bradford Assay (Bio-Rad), et les fractions restantes ont été aliquotées et stockées à -80 ° C pour les dosages enzymatiques. Pour confirmer l'expression de l'INMT, tous les extraits de tissus et de GST-INMT ont été analysés par Western blot. 30 µg de chaque protéine ont été dénaturés dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant du β-mercaptoéthanol et bouillis à 100 ° C pendant 5 min. Les échantillons ont été séparés sur des gels SDS-polyacrylamide standard et électrotransférés sur nitrocellulose. L'analyse Western blot a été réalisée avec des anticorps INMT de rat (polyclonaux de lapin commandés auprès de GenScript), tubuline (monoclonaux de souris de Developmental Studies Hybridoma Bank) et GST (monoclonaux de souris de Fisher), suivie d'une incubation avec des anticorps secondaires marqués au fluorophore infrarouge contre le lapin et souris (Li-COR). Les bandes ont été détectées à l'aide d'un scanner infrarouge Li-COR Odyssey. Les images Western blot résultantes (Figs. 2 et 4) sont présentées sous forme de versions recadrées des fichiers bruts non traités. Voir les documents supplémentaires pour les images non recadrées.

Les sources de protéines pour les dosages enzymatiques comprenaient des extraits de tissus (poumon de lapin, cerveau de rat, poumon de rat) et des GST-INMT recombinants (rat, lapin et humain). Les dosages enzymatiques ont été effectués dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL et contenaient environ 50 µg de protéines (les concentrations de protéines en stock variaient de 4,1 à 6,9 mg/mL pour le cerveau de rat, de 10,6 à 14,6 mg/mL pour les poumons de rat et de lapin et de 0,75 à 1,05 mg/mL pour les GST-INMT recombinantes). Les dosages enzymatiques radiométriques ont utilisé 4 mM de tryptamine (Sigma Aldrich) ou NMT (Cayman Chemical) avec 2,3 nmol de C14-SAM (activité spécifique 52,6 mCi/mmol, PerkinElmer Inc.) dans un volume de réaction final de 150 µL avec du tampon phosphate de sodium. Les composants du test ont été combinés et incubés à 37 ° C pendant 60 min, et les réactions ont été arrêtées en ajoutant 1 ml de tampon borate 0, 5 M glacé (pH 9, 5). Pour extraire les produits de réaction, les mélanges réactionnels ont été transférés dans des tubes Falcon de 15 ml avec 6 ml d'une solution 97:3 de toluène:alcool isoamylique (T:IAA) et les tubes ont été vortexés pendant trois salves de 5 s chacune et centrifugés à 1 650 g pour 3 min. Pour la quantification, 4 ml de la couche organique T:IAA ont été ajoutés à des flacons de scintillation contenant 5 ml de cocktail de scintillation (Ultima Gold; PerkinElmer Inc.) et la radioactivité a été comptée pendant 1 min sur un compteur à scintillation Beckman LS. Les tubes sans substrat (tryptamine) ont servi de témoins de fond. L'activité spécifique (SA) a été calculée en soustrayant le CPM moyen de 3 contrôles de fond pour chaque condition et en divisant la valeur CPM résultante par la quantité de protéine (µg) utilisée. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes d'expériences en triple dans les tissus cérébraux et pulmonaires pour n = 6 rats par génotype, et sous forme de 6 expériences répétées pour chaque condition GST-INMT. Des dosages non radioactifs ont été effectués pour analyse par analyse uHPLC-MS/MS. Ces dosages utilisaient 1 mM de tryptamine ou de NMT avec 33 µM de SAM dans un volume réactionnel final de 150 µL avec du tampon phosphate de sodium. Les composants du test ont été combinés et incubés à 37°C pendant 60 min. Les tubes sans substrat ont servi de témoins de fond. Les produits de réaction ont été immédiatement extraits en ajoutant 1 ml de T:IAA et vortexés. 950 µL de la phase organique ont été transférés dans un nouveau tube de 1,5 mL et le solvant organique a été évaporé sur un concentrateur VacuFuge™ de paillasse (Eppendorf) à température ambiante pendant 2 h. Les produits résultants ont été remis en suspension dans 1 ml de méthanol à 30 %, vortexés pendant 3 min et analysés par uHPLC-MS/MS (voir ci-dessous pour « Méthodes »). Les échantillons qui avaient NMT comme substrat ont été encore dilués dix fois dans du méthanol à 30 %. Des essais avec des extraits de tissus ont été exécutés en double pour chaque rat (n = 6 par génotype), et des essais avec des extraits de GST-INMT ont été exécutés en triple pour chaque condition, avec des transformations GST vectorielles vides servant de témoins de fond. Les identités des échantillons ont été masquées par LC pour l'analyse uHPLC-MS/MS menée par NGG

Pour l'analyse du produit, les dosages INMT ont été répétés pour tous les tissus et GST-INMT recombinants en utilisant les méthodes décrites ci-dessus pour les dosages enzymatiques radiométriques. Les réactions ont été préparées en quatre exemplaires avec ou sans tryptamine dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Pour l'extraction du produit, 1 ml de T:IAA a été ajouté aux tubes de réaction immédiatement après le dosage. Les tubes ont été vortexés trois fois à 5 s d'intervalle et centrifugés à 13 000 tr/min pendant 3 min. Le surnageant a ensuite été transféré dans des tubes de microcentrifugeuse propres et évaporé à 50 ° C pendant une nuit dans un Eppendorf Thermomixer. Les produits résultants de quatre répétitions pour chaque condition ont été regroupés en utilisant 100 µL de T:IAA. Avant le repérage, des plaques de chromatographie en couche mince de gel de silice ont été activées dans un four à 90 ° C pendant 30 min, et un réservoir de développement de chromatographie en couche mince de verre a été prérempli avec 50 ml de phase mobile composée de N-Butanol, acide acétique et l'eau (12:3:5). Les plaques ont été tachées avec un mélange d'étalons comprenant 0,5 µg chacun de tryptamine, NMT et DMT dans T:IAA avec 50 µL de produits de réaction de dosage enzymatique regroupés, tous espacés de 1,0 cm. La plaque a été placée dans la cuve de développement pendant environ 2 h, puis retirée et laissée sécher à l'air pendant 1 h. Les normes de tryptamine, NMT et DMT (visibles sous lumière ultraviolette), ainsi que les origines du produit et les fronts de solvant ont été sur-marqués avec un mélange dilué de C14-SAM pour permettre à ces emplacements d'être visibles avec l'imagerie au phosphore. Pour le développement, la plaque a été enveloppée dans une pellicule plastique et stockée dans un écran phosphore (Molecular Dynamics) pendant 72 h. L'imagerie de l'écran a été réalisée à l'aide d'un Amersham Typhoon Phosphorimager avec une sensibilité de tube photomultiplicateur à 1 000 V, une vitesse de balayage normale et une taille de pixel de 100 µm. Les images résultantes (Fig. 3 et 5) ont été recadrées pour exclure les lignes de repérage et les fronts de solvant, et globalement modifiées avec le logiciel d'imagerie Amersham Typhoon pour améliorer la visibilité des produits de réaction. Des images brutes, non recadrées et non traitées sont fournies dans les documents supplémentaires. Les valeurs du facteur de retardement (RF) ont été déterminées en divisant la distance de migration du soluté par la distance de migration du front de solvant.

Bien que les dosages radiométriques soient très sensibles dans leur capacité à détecter des niveaux extrêmement faibles d'activité enzymatique, ils ne fournissent pas d'informations sur l'identité des produits de réaction. La chromatographie en couche mince est utile pour la visualisation d'une gamme de produits de réaction, mais la technique manque souvent de résolution. uHPLC-MS/MS, cependant, fournit à la fois un niveau élevé de sensibilité et de résolution dans l'identification des analytes et représente un étalon-or pour la séparation, la détection et la quantification des analytes. De plus, notre méthode uHPLC-MS/MS utilise plusieurs techniques pour confirmer définitivement l'identification de l'analyte, y compris le temps de rétention via uHPLC, la surveillance des réactions multiples triple quadripôle des ions précurseurs et produits, et les étalons de référence internes deutérés enrichis pour NMT et DMT.

Pour déterminer les concentrations de NMT et de DMT, 10 µL de la resuspension de méthanol à 30 % (voir la section "Tests enzymatiques") ont été additionnés de 10 µL d'un mélange contenant 100 nM de d3-NMT et de d6-DMT (Toronto Research Chemicals) sous forme deutérée. étalons internes pour normaliser l'efficacité d'extraction et l'efficacité d'ionisation par spectrométrie de masse. Des solutions d'étalonnage de NMT et de DMT ont été préparées dans du méthanol à 30 %, pour créer une plage d'étalonnage de 0,625 à 125 nM pour le NMT et de 0,125 à 25 nM pour le DMT. Les étalons d'étalonnage ont été dopés avec la solution d'étalon interne comme décrit ci-dessus et injectés avant chaque jour d'analyse. Des courbes d'étalonnage à 6 points ont été déterminées sur la base du rapport de surface de pic de l'étalon d'étalonnage à l'étalon interne par régression linéaire. Tous les échantillons et standards ont été analysés à l'aide d'une colonne de chromatographie Phenomenex Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, 100 Å) sur une uHPLC Vanquish (Thermo Fisher Scientific, Gemering, Allemagne) interfacée à un spectromètre de masse triple quadripôle TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher Scientific, San José, Californie). La phase mobile A était du formiate d'ammonium 10 mM avec 0,15 % (v/v) d'acide formique dans de l'eau. La phase mobile B était l'acétonitrile. Le gradient utilisé était le suivant : initial, 5 % B ; 0,01 min, 19 % B; 0,68 min, 26 % B, 1,05 min, 75 % B ; 1,8 min, 100 % B ; 2,2 min, 100 % B ; 2,3 min, 5 % B; 3,0 min, 5 % B à 600 μL/min. Le volume d'injection d'échantillon était de 7,5 µL, l'échantillonneur automatique était maintenu à température ambiante et la colonne était maintenue à 30 °C en mode air immobile. NMT élue à 0,92 min et DMT à 0,96 min. L'ionisation par électrospray a été utilisée en mode positif à 4 kV. La température capillaire était de 325 ° C, la température du vaporisateur était de 300 ° C, la pression du gaz gaine était de 50 et la pression du gaz auxiliaire était de 10. Les ions ont été détectés en mode de spectrométrie de masse en tandem. Les paramètres de balayage pour les 4 analytes étaient les suivants. NMT : ion précurseur m/z = 175, ion produit m/z = 143,8, énergie de collision = 14, lentille tubulaire = 53. d3-NMT : ion précurseur m/z = 178, ion produit m/z = 143,8, énergie de collision = 14, lentille tubulaire = 65. DMT : ion précurseur m/z = 189,1, ion produit m/z = 144,1, énergie de collision = 19, lentille tubulaire = 49. d6-DMT : ion précurseur m/z = 195,1, ion produit m/z = 144,1, énergie de collision = 19, lentille tubulaire = 49. L'intégration automatisée des pics a été réalisée à l'aide du logiciel XCalibur 3.0 MS, et tous les pics ont été inspectés visuellement pour garantir une intégration correcte.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 9.4.1 (La Jolla, CA). Pour les dosages enzymatiques radiométriques, toutes les données présentaient une distribution normale confirmée par le test de normalité de Shapiro-Wilk. Des tests t non appariés, paramétriques et bilatéraux ont été utilisés avec la correction de Welch pour toutes les comparaisons statistiques. Dans le texte, les valeurs p, les moyennes ± écarts-types, les moyennes des différences, les intervalles de confiance (IC) à 95 % et les valeurs t sont indiquées. α = 0,05 pour tous les tests.

Les données et les réactifs seront disponibles sur demande raisonnable de l'auteur correspondant (JB).

Thompson, MA & Weinshilboum, RM ADNc d'indoléthylamine N-méthyltransférase de poumon de lapin et clonage et caractérisation de gènes. J. Biol. Chim. 273, 34502–34510 (1998).

Article CAS Google Scholar

Mandell, AJ & Morgan, M. Indole (éthyl) amine N-méthyltransférase dans le cerveau humain. Nat. Nouveau Biol. 230, 85–87 (1971).

Article CAS Google Scholar

Axelrod, J. La N-méthylation enzymatique de la sérotonine et d'autres amines. J. Pharmacol. Exp. Là. 138, 28–33 (1962).

CAS Google Scholar

Axelrod, J. Formation enzymatique de métabolites psychotomimétiques à partir de composés normaux. Sciences 134, 343–343 (1961).

Article CAS ADS Google Scholar

Thompson, MA et al. Indoléthylamine N-méthyltransférase humaine : clonage et expression d'ADNc, clonage de gènes et localisation chromosomique. Génomique 61, 285-297 (1999).

Article CAS Google Scholar

Dean, JG et al. Biosynthèse et concentrations extracellulaires de N,N-diméthyltryptamine (DMT) dans le cerveau des mammifères. Sci. Rep.-uk 9, 9333 (2019).

Annonces d'article Google Scholar

Cozzi, NV, Mavlyutov, TA, Thompson, MA & Ruoho, AE Expression de l'indoléthylamine N-méthyltransférase dans le tissu nerveux des primates. Soc. Neurosc. Résumé 37, 840 (2011).

Google Scholar

Narasimhachari, N., Lin, R.-L., Plaut, J. & Leiner, K. Méthodes sélectives et spécifiques de chromatographie en couche mince, de chromatographie en phase gazeuse et de chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse pour le dosage de l'activité de l'indoléthylamine N-méthyltransférase. J. Chromatogr. A 86, 123-131 (1973).

Article CAS Google Scholar

Thithapandha, A. Spécificité du substrat et hétérogénéité des N-méthyltransférases. Biochimie. Bioph. Rés. Commun. 47, 301–308 (1972).

Article CAS Google Scholar

Barker, SA, Monti, JA et Christian, ST N, N-diméthyltryptamine : Un hallucinogène endogène. Int. Rév. Neurobiol. 22, 83–110 (1981).

Article CAS Google Scholar

Strassman, RJ, Qualls, CR, Uhlenhuth, EH & Kellner, R. Étude dose-réponse de la N, N-diméthyltryptamine chez l'homme : II. Effets subjectifs et résultats préliminaires d'une nouvelle échelle de cotation. Cambre. Psychiat général. 51, 98–108 (1994).

Article CAS Google Scholar

Barker, SA N, N-diméthyltryptamine (DMT), un hallucinogène endogène : recherches passées, présentes et futures pour déterminer son rôle et sa fonction. Devant. Neurosci.-Suisse. 12, 536 (2018).

Article Google Scholar

Franzen, F. & Gross, H. Tryptamine, N, N-diméthyltryptamine, N, N-diméthyl-5-hydroxytryptamine et 5-méthoxytryptamine dans le sang et l'urine humains. Nature 206, 2061052a0 (1965).

Article Google Scholar

Barker, SA, McIlhenny, EH & Strassman, R. Un examen critique des rapports sur les N, N-diméthyltryptamines psychédéliques endogènes chez l'homme : 1955–2010. Essai de drogue Anal 4, 617–635 (2012).

Article CAS Google Scholar

Saavedra, JM & Axelrod, J. Tryptamines N-méthylées psychotomimétiques : formation dans le cerveau in vivo et in vitro. Sciences 175, 1365-1366 (1972).

Article CAS ADS Google Scholar

Beaton, JM & Morris, PE Ontogénie de la N, N-diméthyltryptamine et des niveaux d'indolealkylamine associés chez les rats nouveau-nés. Mech. Dév. 25, 343–347 (1984).

Article CAS Google Scholar

Kärkkäinen, J. et al. Potentiellement hallucinogènes, les ligands des récepteurs de la 5-hydroxytryptamine, la bufoténine et la diméthyltryptamine, dans le sang et les tissus. Scannez. J.Clin. Laboratoire. Enquête 65, 189-199 (2009).

Article Google Scholar

Barker, SA, Borjigin, J., Lomnicka, I. & Strassman, R. Analyse LC/MS/MS des hallucinogènes endogènes de la diméthyltryptamine, de leurs précurseurs et des principaux métabolites dans le microdialysat de la glande pinéale du rat. Biomédical. Chromatogr. 27, 1690-1700 (2013).

Article CAS Google Scholar

Ansher, SS & Jakoby, WB Amine N-méthyltransférases du foie de lapin. J. Biol. Chim. 261, 3996–4001 (1986).

Article CAS Google Scholar

Mandel, LR, Rosenzweig, S. & Kuehl, FA Purification et spécificité de substrat de l'indoleamine-N-méthyl transférase. Biochimie. Pharmacol. 20, 712-716 (1971).

Article CAS Google Scholar

Morgan, M. & Mandell, AJ Indole (éthyl) amine N-méthyltransférase dans le cerveau. Sciences 165, 492–493 (1969).

Article CAS ADS Google Scholar

Saavedra, JM, Coyle, JT & Axelrod, J. La distribution et les propriétés de la N-méthyltransférase non spécifique dans le cerveau. J. Neurochem. 20, 743–752 (1973).

Article CAS Google Scholar

Porta, R., Esposito, C., Camardella, M. et Pietra, GD Formes multiples d'indoleamine-N-méthyltransférase pulmonaire de lapin. Int. J. Biochem. 10, 919-923 (1979).

Article CAS Google Scholar

Bisswanger, dosages H. Enzyme. Perspective. Sci. 1, 41–55 (2014).

Article Google Scholar

Barker, SA, Beaton, JM, Christian, ST, Monti, JA & Morris, PE Comparaison des niveaux cérébraux de N, N-diméthyltryptamine et α, α, β, β-tétradeutéro-N, N-diméthyltryptamine après injection intrapéritonéale Effet isotopique cinétique IN VIVO. Biochimie. Pharmacol. 31, 2513-2516 (1982).

Article CAS Google Scholar

Dai, J., Dan, W., Schneider, U. et Wang, J. Monomères et dimères d'alcaloïdes β-carboline: Occurrence, diversité structurelle et activités biologiques. EUR. J. Med. Chim. 157, 622–656 (2018).

Article CAS Google Scholar

Ducrot, P., Rabhi, C. & Thal, C. Synthèse de tétrahydro-β-carbolines et études de la réaction Pictet-Spengler. Tétraèdre 56, 2683–2692 (2000).

Article CAS Google Scholar

Stöckigt, J., Antonchick, AP, Wu, F. & Waldmann, H. La réaction Pictet-Spengler dans la nature et en chimie organique. Angew. Chim. Int. Éd. 50, 8538–8564 (2011).

Article Google Scholar

Cao, N. et al. Changements dynamiques de l'harmine alcaloïde β-carboline endogène ou exogène chez différents mammifères et humains in vivo à des états de développement et physiologiques. Devant. Neurosciences vieillissantes. 13, 773638 (2022).

Article Google Scholar

Gomes, UR, Neethling, AC & Shanley, BC N-méthylation enzymatique des indoléamines par le cerveau des mammifères : fait ou artefact ?. J. Neurochem. 27, 701–705 (1976).

Article CAS Google Scholar

Boarder, MR & Rodnight, R. Activité tryptamine-N-méthyltransférase dans le tissu cérébral : un réexamen. Cerveau Res. 114, 359–364 (1976).

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Ce travail a été soutenu par le département de physiologie moléculaire et intégrative, la subvention MCube (à JB, MMW et YK), une subvention du Center for Consciousness Science (à JB) de l'Université du Michigan et une subvention de PharmaDrug Inc. (à JB). Nous remercions le Dr Brian Shay, qui a conseillé sur les techniques uHPLC-MS/MS, Gregg Sobocinski qui a soutenu les études d'imagerie au phosphore, ainsi que le Dr Steven Barker, qui a partagé des informations et des conseils précieux sur la méthodologie expérimentale et l'interprétation des résultats. MMW a été soutenu par la subvention NS099160 des National Institutes of Health (NIH) et la subvention VA BX003824. RTK était pris en charge par NIH RF1NS128522.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Nicolas G. Glynos et Lily Carter.

Département de physiologie moléculaire et intégrative, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Nicolas G. Glynos, Lily Carter, Michael M. Wang et Jimo Borjigin

Michigan Psychedelic Center, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Nicolas G. Glynos, George A. Mashour & Jimo Borjigin

Département de neurologie, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Soo Jung Lee, Michael M. Wang et Jimo Borjigin

Anciens Combattants Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, États-Unis

Soo Jung Lee et Michael M. Wang

Département de chimie, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Youngsoo Kim et Robert T. Kennedy

Département d'anesthésiologie, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

George A. Mashour

Programme d'études supérieures en neurosciences, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

George A. Mashour, Michael M. Wang et Song Borjigin

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

JB a conçu l'idée de l'étude et dirigé les expériences. LC et NGG ont réalisé des expériences et analysé des données avec l'aide de JBSJL. Le travail sur les protéines recombinantes a été dirigé et soutenu par SJL et MMW. Le développement et l'analyse de la méthode uHPLC-MS/MS ont été soutenus par YK et RTK. La génération de rats INMT-KO a été soutenue par GAM. NGG a écrit le manuscrit avec l'aide de JB et LC

Correspondance à Jimo Borjigin.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Glynos, NG, Carter, L., Lee, SJ et al. L'indoléthylamine N-méthyltransférase (INMT) n'est pas essentielle pour l'activité de méthylation dépendante de la tryptamine endogène chez le rat. Sci Rep 13, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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Reçu : 26 septembre 2022

Accepté : 04 janvier 2023

Publié: 06 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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