Etude Métabolomique Intégrée du Lait de Chaleur - Stockage cryogénique Chengdu Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 24208 (2016) Citer cet article

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Le stress thermique (HS) nuit à l'industrie laitière mondiale en réduisant les rendements et la qualité du lait, en nuisant à la santé et en endommageant la reproduction des vaches laitières, causant d'énormes pertes économiques chaque année. Cependant, la compréhension du mécanisme physiologique des vaches laitières en lactation HS reste insaisissable. Ici, une étude métabolomique utilisant la spectroscopie LC-MS et RMN 1H a été réalisée pour analyser les différences métabolomiques dans le lait entre les vaches laitières sans HS et les vaches laitières HS, et découvrir des biomarqueurs diagnostiques et des changements dans la voie métabolique. Un total de 53 métabolites discriminants étaient significativement régulés à la hausse ou à la baisse dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,05). Ces biomarqueurs étaient impliqués dans les voies du métabolisme dérivé des glucides, des acides aminés, des lipides et du microbiome intestinal. En comparant ces biomarqueurs potentiels avec des biomarqueurs candidats HS précédemment identifiés dans le plasma, des corrélations significatives entre les niveaux de lactate, de pyruvate, de créatine, d'acétone, de β-hydroxybutyrate, de triméthylamine, d'acide oléique, d'acide linoléique, de lysophosphatidylcholine 16:0 et de phosphatidylcholine 42:2 dans du lait et du plasma ont été trouvés, ce qui indique que la barrière sang-lait est devenue perméable et que les niveaux de ces 10 biomarqueurs dans le lait peuvent refléter des altérations métabolomiques induites par HS dans le sang. Ces nouvelles découvertes peuvent soutenir des recherches plus approfondies pour élucider les changements liés au lait dans les voies métaboliques chez les vaches laitières en lactation HS.

Les vaches laitières en lactation soumises à un stress thermique (HS) ont un apport énergétique limité, car elles ne peuvent pas répondre aux exigences de leur corps pour produire du lait et rester en bonne santé, ce qui entraîne une réduction de la production et de la qualité du lait et rend les vaches laitières vulnérables aux maladies1,2. En conséquence, d'importantes pertes économiques se produisent dans l'industrie laitière de nombreux pays, tels que la Chine3,4, les États-Unis5 et l'Allemagne6. Les perturbations métabolomiques induites par l'HS sont directement responsables de ces pertes1,7. Ceci est particulièrement important étant donné les tendances à l'augmentation de la productivité laitière grâce aux technologies génétiques moléculaires modernes accompagnées des augmentations de température résultant du changement climatique mondial8.

Une détermination précise du moment où les vaches entrent en HS est compliquée car les réponses à l'HS affectent non seulement le bilan énergétique, mais aussi le métabolisme de l'eau, du sodium, du potassium et du chlore9. Bien que l'indice de température et d'humidité (THI) reste l'indicateur le plus courant de l'HS, l'utilisation de la valeur THI de 72 comme seuil d'apparition de l'HS10 ne permet que des jugements basés sur la température et l'humidité de l'air, n'est pas une mesure précise du métabolisme altérations chez les vaches laitières sous HS, et ne tient pas compte des effets spécifiques à la vache (âge et race) et d'autres facteurs environnementaux. En effet, les changements physiologiques induits par l'HS chez les vaches laitières sont multifactoriels7. Des biomarqueurs de métabolites robustes sont nécessaires pour diagnostiquer le seuil d'apparition de l'HS, surveiller sa progression et fournir des informations sur ses mécanismes physiologiques, permettant ainsi la mise en œuvre d'interventions opportunes pour protéger les vaches laitières contre des maladies telles que la cétose.

Des recherches antérieures sur les performances des vaches laitières se sont concentrées sur les changements induits par l'HS dans leur fréquence respiratoire, leur fréquence cardiaque, leur production de lait, leur nombre de cellules somatiques et leurs protéines, lipides, lactose, acides gras non estérifiés (AG) basaux, insuline, thyroïde , de noradrénaline, de glucose et d'azote uréique plasmatique dans le lait7,11. Cependant, peu d'études ont abordé les changements globaux dans les voies métaboliques, et les mécanismes sous-jacents à ces changements restent inconnus.

La métabolomique représente une plate-forme puissante pour acquérir les informations de centaines de milliers de métabolites de faible poids moléculaire chez les plantes, les animaux et les humains, et peut être utilisée pour fournir une compréhension globale des altérations physiopathologiques stimulées par les changements environnementaux12,13,14,15 . Chez les vaches laitières, le lait peut être très facilement collecté, renseigne sur l'évolution des mécanismes de lactation des vaches laitières et peut être directement analysé pour déterminer sa qualité nutritionnelle. Par conséquent, le lait est considéré comme l'échantillon biologique idéal pour surveiller les altérations physiologiques. Comparé au prélèvement sanguin, le prélèvement de lait est non invasif et se produit quotidiennement, et ainsi, les états métaboliques des vaches laitières peuvent être observés en temps réel. En conséquence, les vaches peuvent être surveillées et leur état HS déterminé, et des stratégies de gestion rapides peuvent être mises en œuvre pour réduire l'impact de l'HS. Par conséquent, la présente étude a utilisé la spectroscopie LC-MS et 1H RMN pour identifier les différences métaboliques dans le lait des vaches en milieu de lactation avec et sans HS afin d'identifier les biomarqueurs HS et d'explorer les altérations des voies métaboliques des vaches laitières en lactation dans différents états HS. La LC-MS en mode de surveillance de réactions multiples (MRM) a également été utilisée pour vérifier la fiabilité des métabolites discriminants. Des analyses de corrélation partielle de Pearson des biomarqueurs candidats trouvés dans le lait avec ceux dans le sang16 ont été réalisées pour suivre les causes des métabolites perturbés dans le lait. Les concentrations de cytokines, de protéine c-réactive et de cytochrome c ont été détectées à l'aide de dosages immuno-enzymatiques (ELISA) pour obtenir des informations sur l'inflammation et l'apoptose induites par HS. Globalement, les résultats de cette étude améliorent notre compréhension des altérations métaboliques chez les vaches laitières exposées au HS. Un aperçu de la conception de l'étude est présenté à la Fig. 1.

HS, stress thermique ; MTBE, méthyl tert-butyl éther ; RMN, résonance magnétique nucléaire ; MVDA, analyse de données statistiques multivariées ; ACP, analyse en composantes principales ; PLS-DA, analyse discriminante des moindres carrés partiels ; OPLS-DA, analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonaux.

Les parcelles d'analyse discriminatoire des moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS-DA) des données métabolomiques ont montré une séparation claire entre les groupes sans HS et HS, sans aucun chevauchement (Fig. 2A, B), indiquant que le profil métabolique était significativement modifié dans les échantillons de lait HS. Les données RMN 1H du sérum et de la graisse du lait (Fig. 2A) et les données LC-MS du métabolome du lait (Fig. 2B) pour les groupes sans HS et HS ont identifié une composante prédictive et deux composantes orthogonales avec une modélisation et une prédiction satisfaisantes. capacités de 81,36 % < R2 (Y) <88,2 % et 63,9 % < Q2 (cum) <86,1 %. Pour éviter le surajustement du modèle, une validation croisée sur trois composants avec 999 tests de permutation aléatoires a été effectuée et a produit des interceptions de 0,015

(A) Parcelles OPLS-DA des données RMN 1H du sérum de lait et de la graisse. (B) Parcelles OPLS-DA des données LC-MS pour le métabolome du lait. (C, D) Parcelles de validation des modèles d'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) acquis par 999 tests de permutation pour les données RMN 1H du sérum et de la graisse du lait et les données LC-MS du métabolome du lait, respectivement.

En analysant les données de RMN 1H, nous avons identifié un total de 25 candidats métaboliques, qui sont présentés dans le tableau 1. Ces métabolites étaient des glucides, des acides aminés, des lipides et des métabolites dérivés du microbiome intestinal, ce qui suggère que ces voies métaboliques ont été modifiées dans le HS. groupe. La figure 3 montre un exemple des spectres RMN 1H des métabolites identifiés à partir de la matière grasse du lait.

(A) AG, acides gras. (B) CT, cholestérol total. (C) UFA, acides gras insaturés ; TAG, triacylglycérides. (D) AGPI, acides gras polyinsaturés.

L'analyse des données LC-MS a révélé que 119 métabolites différaient entre les groupes sans HS et HS, 33 de ces métabolites restant après l'élimination des variables redondantes à l'aide d'une combinaison de chromatogrammes d'ions extraits et de la collection R-package d'algorithmes pour le profil métabolite Annotation (CAMÉRA)16,19. Pour vérifier ces 33 métabolites, une détection confirmatoire a été réalisée par LC-MS en mode MRM. Au final, 28 candidats ont été vérifiés et identifiés (tableau 2). À l'exception de l'urée, les 27 autres composés étaient des métabolites lipidiques, indiquant que le métabolisme des lipides était perturbé dans le groupe HS.

Les métabolites identifiés par RMN 1H qui différaient entre les groupes HS et sans HS sont présentés dans le tableau 1, et une carte thermique a été construite sur la base des altérations de ces candidats potentiels (Fig. 4A). Des altérations induites par HS dans les métabolites liés aux glucides ont été observées pour le lactate, le pyruvate, le galactose-1-phosphate et le citrate, dont les concentrations ont été multipliées par 1,27 à 1,79 dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS ( P < 0,002), à l'exception du fumarate a diminué de 0,78 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,001). Les concentrations d'isoleucine, de proline, d'orotate, de glycine et de phosphocréatine, qui sont des métabolites liés aux protéines ou aux acides aminés, ont été modifiées de 0,69 à 0,88 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,001). La créatine a été augmentée de 1,59 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,001). Les concentrations de butyrate, acétone, β-hydroxybutyrate (BHBA), FA, PUFA et UFA, métabolites liés aux lipides, ont été augmentées de 1,08 à 1,38 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,02 ). Les concentrations de N-acétylsucre A, N-acétylsucre B, N-acétylsucre C, N-acétylsucre D et TC ont été modifiées de 0,68 à 0,91 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,01 ). Des perturbations induites par HS du métabolisme dérivé du microbiome intestinal ont également été identifiées, les concentrations de triméthylamine (TMA) étant modifiées de 0, 52 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS ( P <0, 001).

Représentation de la carte thermique du regroupement hiérarchique non supervisé des données RMN 1H (A) et des données LC-MS (B) des échantillons HS et sans HS. Les nuances de rouge et de vert représentent respectivement les augmentations et les diminutions de la concentration du métabolite, par rapport à son niveau dans le groupe sans HS. Rangées : métabolites ; colonnes : échantillons.

Les métabolites identifiés par LC-MS modifiés par HS sont présentés dans le tableau 2, et une carte thermique a été construite sur la base des altérations de ces candidats potentiels entre les groupes sans HS et HS (Fig. 4B). La plupart de ces métabolites sont des lipides, les concentrations d'acide oléique, d'acide linoléique et de lysophosphatidylcholine (lysoPC) 16:0 étant modifiées de 1,28 à 1,41 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,005), et la phosphatidylcholine (PC), la sphingomyéline (SM), le monoacylglycérol (MG), le diacylglycérol (DG) et le triradylglycérol (TG) ont changé de 0,48 à 0,83 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,02). La concentration d'urée, qui est liée aux acides aminés, a été augmentée de 1,32 fois dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS (P < 0,01).

Le tableau 3 répertorie les coefficients de corrélation des métabolites candidats dans le plasma et le lait avec des corrections pour les groupes de traitement (HS et sans HS). Des corrélations significatives ont été observées entre les niveaux de lactate, de pyruvate, de créatine, d'acétone, de BHBA et de TMA dans le plasma et dans le lait (P < 0,001). La signification des corrélations pour l'acide oléique, l'acide linoléique, le lysoPC 16:0 et le PC 42:2 était inférieure à 0,01. De plus, des corrélations significatives ont également été détectées entre les niveaux de lactate et de pyruvate, et les niveaux d'acétone et de BHBA dans le lait et le plasma (P < 0,01).

Le tableau supplémentaire S6 répertorie les modifications des concentrations de TNF-α, IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, protéine c-réactive, p53, Bax, Bcl-2, cytochrome c, caspase-3, caspase -8 et la caspase-9 dans le plasma et le lait des groupes HS et sans HS. Les niveaux de toutes ces protéines étaient significativement plus élevés dans le groupe HS que dans le groupe sans HS (P < 0,05), à l'exception de Bcl-2 et IL-12 étant significativement plus faibles dans le groupe HS que dans le groupe HS- groupe libre (P < 0,05).

Le tableau supplémentaire S7-S8 répertorie les coefficients de corrélation entre la température rectale et les niveaux de métabolites candidats dans le plasma et le lait, respectivement. Des corrélations significatives ont été observées entre les taux de lactate, de pyruvate, de créatine, de proline, de lysine, de glycine, de thréonine, d'isoleucine, de leucine, d'ornithine, de citrulline et d'arginine dans le plasma et la température rectale (P < 0,01), ainsi qu'entre le lactate, les taux de pyruvate, de créatine et de citrate dans le lait et la température rectale (P < 0,01). Le tableau supplémentaire S9 affiche les coefficients de corrélation pour les niveaux de cytokines et de métabolites candidats dans le plasma et le lait. Des corrélations significatives ont été notées entre p53, Bax, Bcl-2 et le cytochrome c et l'acétone et le BHBA dans le plasma et le lait (P < 0,01). Le tableau supplémentaire S10 répertorie les corrélations significatives entre les niveaux de cytochrome c et de protéine c-réactive dans le plasma et le lait (P <0,01).

Dans la présente étude, 53 biomarqueurs potentiels de métabolites qui pourraient être utilisés pour diagnostiquer les états HS des vaches laitières en lactation ont été identifiés. Ces biomarqueurs potentiels étaient impliqués dans les voies du métabolisme dérivé des glucides, des acides aminés, des lipides et du microbiome intestinal, ce qui indique que ces voies métaboliques étaient influencées par l'HS.

HS a régulé à la hausse les niveaux de pyruvate et de lactate dans le lait des vaches laitières HS dans la présente étude métabolomique, comme observé dans notre précédente étude métabolomique du plasma des vaches laitières HS16. Des analyses de corrélation (tableau 3) des niveaux de pyruvate ou de lactate dans le plasma et le lait de vaches HS et sans HS ont révélé que les concentrations plasmatiques de pyruvate et de lactate étaient significativement corrélées avec leurs concentrations respectives dans le lait, indiquant que ces deux métabolites sont directement sécrétés par le sang dans le lait via la glande mammaire20.

La concentration de citrate de lait a été augmentée dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS. Cette espèce a été utilisée comme biomarqueur du bilan énergétique chez les vaches laitières et est corrélée à la présence de corps cétoniques dans le lait et à la synthèse de novo d'AG21. Parce que l'épithélium mammaire est imperméable au citrate dans les deux sens, les niveaux de citrate du lait reflètent une perturbation induite par HS dans la fonction mammaire plutôt qu'une perturbation du métabolisme général. Les différences insignifiantes dans les niveaux de citrate plasmatique entre les groupes HS et sans HS notées dans notre étude précédente16 confirment davantage l'hypothèse selon laquelle les niveaux de citrate du lait reflètent une perturbation induite par HS dans la fonction mammaire plutôt que des altérations du métabolisme du citrate sanguin. La concentration réduite de fumarate dans les échantillons de lait HS peut avoir été causée par un métabolisme énergétique perturbé et une fonction altérée du cycle de l'acide tricarboxylique22.

Le lactose est le sucre prédominant dans le lait de la plupart des espèces. Le rôle du métabolisme du glucose dans la production de lait est de transporter le glucose du sang dans la glande mammaire pour la synthèse du lactose, et a une fonction vitale dans la production de lait liée à l'osmorégulation du lait23,24. Bien que la présente étude n'ait pas identifié de différences significatives dans les concentrations de lactose du lait entre les groupes HS et sans HS, les rendements laitiers du groupe HS ont été considérablement réduits (tableau supplémentaire S4) par rapport au groupe sans HS (P < 0,01) . En conséquence, les rendements en lactose ont été réduits, ce qui suggère que moins de glucose sanguin était disponible pour les glandes mammaires ou que la synthèse du lactose était perturbée.

L'augmentation de la concentration de galactose-1-phosphate dans le lait était probablement attribuable à la fuite de ce composant des cellules épithéliales mammaires dans le lait, peut-être par l'apoptose cellulaire, et semble être fortement dépendante des états du bilan énergétique25. Un bilan énergétique négatif (NEB) peut augmenter considérablement l'indice apoptotique dans la glande mammaire25. Les vaches laitières HS sont dans un état NEB, ce qui peut avoir causé l'augmentation des niveaux de galactose-1-phosphate dans le lait dans la présente étude. La diminution des niveaux de N-acétylsucre A, N-acétylsucre B, N-acétylsucre C et N-acétylsucre D dans le groupe HS indique que HS modifie leur synthèse en réduisant les niveaux de leurs précurseurs ou en influençant les enzymes apparentées.

Des concentrations réduites d'isoleucine, de proline, d'orotate, de glycine et de phosphocréatine ont été détectées dans les échantillons de lait du groupe HS par rapport à ceux du groupe sans HS. Cependant, les concentrations de ces métabolites étaient régulées à la hausse dans le plasma des vaches laitières HS dans notre précédente étude métabolomique16. Ces acides aminés pourraient être les principaux précurseurs de la production de glucose via la gluconéogenèse ou de la production d'énergie par désamination et oxydation26, diminuant éventuellement leur distribution dans le lait via la glande mammaire. À l'intérieur de la cellule, les acides aminés sont impliqués dans des réactions métaboliques produisant, entre autres, du CO2, de l'urée, des polyamines et des acides aminés non essentiels (NEAA). L'augmentation de la concentration d'urée dans les échantillons de plasma des vaches laitières HS indique que plus d'acides aminés ont été métabolisés en urée qu'en protéines de lait à l'intérieur des cellules de la glande mammaire. La température rectale était significativement corrélée avec les niveaux de proline, de lysine, de créatinine, de thréonine, d'isoleucine, de leucine, d'ornithine, de citrulline, d'arginine et de créatine dans le plasma (tableau supplémentaire S7), suggérant que HS augmentait le catabolisme de la protéine du muscle squelettique en amino acides dans le plasma27. Des corrélations significatives ont été observées entre la température rectale et les niveaux de lactate et de pyruvate dans le plasma et le lait (tableau supplémentaire S8), indiquant une glycolyse anaérobie accrue.

Chez les vaches en lactation, le NEB est associé à la mobilisation des réserves énergétiques de l'organisme, conduisant à une lipolyse prolongée du tissu adipeux et à la répartition des AG non estérifiés dans la circulation sanguine25. Cette répartition influencera le profil des AG dans le lactosérum, par exemple en augmentant les concentrations d'AG insaturés (UFA), principalement C18:1 (acide oléique) et C18:2 (acide linoléique). La même tendance a également été observée dans nos résultats pour la composition en matières grasses du lait, qui ont montré une concentration plus élevée d'AGPI et d'AG polyinsaturés (AGPI) dans le lait des vaches du groupe HS. Chez les vaches, la présence d'UFA a été liée à des maladies inflammatoires, telles que la mammite et la métrite. Le cholestérol est transporté dans tout le corps via des particules de lipoprotéines. Une étude précédente sur le plasma de vaches laitières en lactation sous HS a montré que HS réduisait les concentrations de lipoprotéines de haute densité (HDL) et de lipoprotéines de très basse densité/lipoprotéines de basse densité (VLDL/LDL), diminuant leur apport au système mammaire. cellules16. La concentration de cholestérol dans les matières grasses du lait était plus faible dans le groupe HS que dans le groupe sans HS, ce qui indique que la synthèse et le transport du cholestérol dans le lait sont limités sous HS.

Les concentrations de BHBA et d'acétone étaient significativement augmentées dans le groupe HS par rapport au groupe sans HS. Ces changements concordaient avec notre précédente étude de métabolomique plasmatique sur les vaches laitières HS16. L'analyse de corrélation partielle a révélé que les concentrations de BHBA et d'acétone dans le lait des vaches laitières en lactation dans les états HS et sans HS étaient significativement corrélées avec leurs concentrations plasmatiques rapportées dans une étude précédente (P < 0,01)16, indiquant que le BHBA et l'acétone dans le sang passe inchangée dans le lait via les cellules mammaires. Ainsi, des concentrations élevées de BHBA et d'acétone dans le lait peuvent indiquer une augmentation des taux sanguins de BHBA et d'acétone, qui sont des marqueurs bien connus du statut énergétique des vaches laitières et reflètent une mobilisation excessive des protéines et un apport insuffisant en glucose21.

Une augmentation de la protéine P53, Bax, du cytochrome c, de la caspase-3, de la caspase-8, de la caspase-9 et une diminution de Bcl-2, qui sont toutes des molécules liées à l'apoptose28, ont été détectées à la fois dans le plasma et le lait du groupe HS. L'augmentation de la protéine P53 peut faciliter la biosynthèse des protéines de routage pour l'apoptose. L'équilibre du rapport Bcl-2 et Bax agit comme un régulateur important de la réponse mitochondriale aux signaux apoptotiques, et son déséquilibre peut conduire à la libération de cytochrome c, prédisant l'apoptose cellulaire. L'activation par cisaillement de la caspase-8 peut initier une réaction en cascade de la caspase. La caspase-3 et la caspase-9 sont respectivement considérées comme exécutant et initiateur de l'apoptose. Les concentrations de BHBA et d'acétone étaient significativement corrélées avec la protéine P53, Bax, Bcl-2 et le cytochrome c dans le plasma et le lait (tableau supplémentaire S9), ce qui suggère que le NEB augmentait l'apoptose29.

Les concentrations de PC, y compris PC 40:1, PC 40:0, PC 42:2, PC 44:3 et PC 44:1, étaient plus faibles dans le groupe HS que dans le groupe sans HS, alors que les concentrations de lysoPC 16:0 étaient plus élevés dans le groupe HS que dans le groupe sans HS. Les lysoPC sont des métabolites du catabolisme de la PC, qui est régulé par les phospholipases A1, A2 et D30,31. Les modifications observées dans les concentrations de PC et de lysoPC étaient cohérentes avec notre précédente étude métabolomique plasmatique des vaches laitières HS16. D'autres métabolites liés aux lipides dans le lait, tels que SM, MG, DG et TG, étaient également régulés à la baisse dans le groupe HS. Pris ensemble, ces résultats montrent clairement que l'HS induit des altérations globales du métabolisme des lipides dans le sang et le lait des vaches laitières en lactation.

Il y avait une forte corrélation entre les niveaux de TMA dans le lait et le plasma, indiquant que des modifications des niveaux plasmatiques de TMA16 influençaient sa concentration dans le lait (tableau 3). Nous avons constaté que HS provoquait une réduction marquée des niveaux de TMA dans le lait chez les vaches HS par rapport aux vaches sans HS (tableau 1). Ceci nous porte à croire que l'HS induisait des variations dans le nombre et/ou l'activité des microbes intestinaux.

La fonction immunitaire des vaches peut être affectée par HS32. L'augmentation de la protéine c-réactive, du TNF-α, de l'IL-2, de l'IL-10, de l'IL-15 et la diminution de l'IL-12 dans le plasma et le lait du groupe HS sont considérées comme une réponse à l'inflammation induite par l'HS29,33,34 , confirmant l'affaiblissement du système immunitaire dans le groupe HS. Les taux plasmatiques de cytochrome c et de protéine c-réactive étaient significativement corrélés à leurs concentrations respectives dans le lait (tableau supplémentaire S10), suggérant que le HS induisait une réponse inflammatoire de tout le corps des vaches laitières33. Lors d'une réponse immunitaire mammaire, la barrière sang-lait est compromise35. Par conséquent, notre régulation à la hausse ou à la baisse des niveaux de lactate, de pyruvate, de créatine, d'acétone, de BHBA, de TMA, d'acide oléique, d'acide linoléique, de lysoPC 16:0 et de PC 42:2 dans le plasma16 a également été observée dans le lait. dans la présente étude (tableau 3). Bien que les niveaux de ces 10 biomarqueurs candidats dans le lait aient été significativement corrélés avec leurs concentrations respectives dans le sang, les 43 biomarqueurs potentiels restants (tableaux 1 et 2) dans le lait n'ont pas montré de corrélations similaires, ce qui indique que les 10 premiers biomarqueurs peuvent refléter les effets induits par l'HS. perturbations des métabolites sanguins, tandis que les 43 restants reflètent une fonction mammaire perturbée plutôt que des perturbations métaboliques générales.

Parce que les niveaux des biomarqueurs candidats lactate, pyruvate, créatine, acétone, BHBA, TMA, acide oléique, acide linoléique, lysoPC 16:0 et PC 42:2 dans le lait ont montré de fortes corrélations avec leurs concentrations respectives dans le sang de HS- vaches laitières en liberté et HS, la détection de ces métabolites du lait permet de diagnostiquer les états HS et les perturbations induites par HS dans le métabolisme général. D'autres biomarqueurs potentiels peuvent refléter les altérations induites par HS dans la fonction mammaire des vaches laitières HS. Les résultats identifient des biomarqueurs potentiels qui pourraient être utilisés pour surveiller avec précision les états HS des vaches laitières en lactation et méritent une enquête plus approfondie pour élucider les mécanismes physiologiques sous-jacents aux changements induits par HS dans les voies métaboliques. Cela pourrait mener à de meilleures pratiques de gestion pour les vaches laitières exposées au HS.

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été menées selon les principes du comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Académie chinoise des sciences agricoles (Pékin, Chine), qui a approuvé les protocoles d'étude.

L'oxyde de deutérium et le chloroforme deutéré ont été achetés auprès de USA Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA, USA); et le sel de sodium de l'acide 3-(triméthylsilyl) propionique-2,2,3,3,d4 propionique a été acheté auprès de Merck Canada Inc. (Kirkland, QC, Canada). Le méthanol de qualité HPLC, l'éther méthyltert-butylique, l'eau, l'acide formique et le formiate d'ammonium ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne).

Selon NRC (1971), THI a été calculé à l'aide de la formule : THI = (1,8 × Tdb + 32) −[(0,55−0,0055 × RH) × (1,8 × Tdb −26,8)], où Tdb est la température de bulbe sec (°C) et RH est l'humidité relative (%). Quarante-quatre vaches Holstein en deuxième parité à mi-lactation qui ont reçu le même régime alimentaire ont été utilisées dans cet essai. Le groupe sans HS était composé de 22 vaches, avec des échantillons de lait obtenus au printemps sous un ITH de 50 à 55 pendant un mois. Le groupe HS était composé de 22 vaches, avec des échantillons prélevés en saison estivale, après que le THI est passé progressivement de 68 à 80 sur 1 mois et est resté stable à 80 pendant 1 semaine. Des échantillons de lait du matin ont été prélevés avant la tétée et stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation ultérieure. Les caractéristiques détaillées des vaches laitières sélectionnées, la composition des aliments, la température, l'humidité, la température rectale, le taux de respiration et les caractéristiques de production des deux groupes de vaches laitières sont présentées dans le tableau supplémentaire S1-S4 référencé à l'article rapporté16.

Les échantillons de lait ont été décongelés à température ambiante, homogénéisés et centrifugés à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C. Tous les échantillons ont été analysés à 298 K à l'aide d'un SPECTROMÈTRE RMN VARIAN VNMRS 600 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA) fonctionnant à 599,871 MHz à l'aide d'une sonde à triple résonance à proton inverse (HX) de 5 mm avec bobine à gradient d'axe z . Les spectres RMN 1H du sérum de lait ont été enregistrés à l'aide de la séquence d'impulsions CPMG 1D standard à suppression d'eau (RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ), où un délai de relaxation spin–spin total fixe de 2nτ de 320 ms ont été appliqués pour atténuer les signaux RMN larges des molécules à rotation lente (telles que les protéines) et conserver ceux des composés de faible poids moléculaire et de certains composants lipidiques36. Les désintégrations d'induction libre (FID) ont été collectées via 64 points de données K avec une largeur spectrale de 12000 Hz et 128 balayages. Les FID ont été remplis de zéros pour doubler leur taille et multipliés par un facteur d'élargissement de ligne exponentiel de 0,5 Hz avant la transformation de Fourier (FT). Les spectres RMN 1H de la matière grasse laitière ne nécessitent pas de présaturation de la résonance de l'eau. Ici, nous avons utilisé une simple séquence d'acquisition d'impulsions 901 parce que nous mesurions des spectres entièrement relaxés. Nous avons collecté 64 transitoires dans 32 768 points de données ; les autres paramètres étaient les suivants : délai de relaxation = 2 s, largeur spectrale = 20 ppm et temps d'acquisition = 1,36 s. Les métabolites ont été identifiés en insérant les spectres expérimentaux dans la base de données spectrale Chenomx (Edmonton, AB, Canada) et en les comparant avec les spectres de composés standards.

Cinquante microlitres (50 μL) de lait ont été mélangés avec 350 μL de solvants composés de méthanol et de méthyl tert-butyl éther (MTBE) dans un rapport 1:1 (v:v), et de l'acétate de vitamine E a été ajouté comme étalon interne ( IS), à une concentration finale de 25 ppm. La solution a été filtrée à travers une plaque filtrante Captiva à 96 puits (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Les analyses LC-MS/MS ont été effectuées à l'aide du système 20ADXR Shimadzu ultra-rapide LC (UFLC) et d'un spectromètre de masse Triple TOF 5600 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Concord, ON, Canada). Cinq microlitres (5 μL) d'échantillons préparés ont été injectés dans une colonne à 40 °C (ACQUITY UPLC HSS T3 1,8 μm, colonne 2,1 × 100 mm, Waters, Dublin, Irlande). La température de l'échantillonneur automatique a été maintenue à 15 °C. Le gradient consistait en une phase mobile A (formiate d'ammonium 10 mM dans de l'eau) et une phase mobile B (formiate d'ammonium 10 mM dans du méthanol) pompées à 0,3 mL/min pendant une durée totale de 33 min. Les gradients linéaires étaient : 70 % B à 1 min, 99 % B à 15 min, 99 % B à 20 min, 1 % B à 20,1 min et 1 % B à 33 min. La source d'ionisation par électrospray (ESI) a été configurée en mode d'ionisation positive. Les paramètres MS pour la détection étaient les suivants : tension de source ESI 5,5 kV ; température du vaporisateur, 550 °C ; pression du gaz de séchage (N2), 60 psi ; pression du gaz nébuliseur (N2), 60 psi ; pression du gaz rideau (N2), 30 psi ; et potentiel de dégroupage, 50 V. La plage de balayage était m/z 60–1 000. L'acquisition et le traitement des données ont été effectués à l'aide du logiciel Analyst® TF 1.6 (Applied Biosystems/MDS Sciex). L'auto-étalonnage a été effectué à l'aide du système de distribution de calibrant dans les modes ions positifs et négatifs. Les métabolites ont été identifiés en utilisant le mode d'acquisition dépendant de l'information dans les analyses MS/MS. L'énergie de collision était de 35 eV. La SM haute résolution, les rapports d'abondance des isotopes, la SM/SM, la base de données du métabolome humain, la base de données METLIN37, une recherche documentaire et des comparaisons avec des normes ont été utilisées pour identifier les structures ioniques. Des échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été détectés une fois toutes les 10 analyses LC-MS pour surveiller la reproductibilité de l'instrument. Les échantillons de plasma des différents groupes ont été alternés au hasard au cours de l'analyse. L'auto-étalonnage a été effectué à l'aide du système de distribution de calibrant dans les modes ions positifs et négatifs.

Les spectres RMN 1H bruts ont été corrigés manuellement pour les distorsions de phase et de base à l'aide du logiciel TopSpin (version 3.0; BrukerBiospin) et ont été référencés à la résonance doublet anomérique du lactose (δ 5,233 ppm) pour les spectres de sérum de lait et le 3- (triméthylsilyl) propionique Signal de sel de sodium de l'acide 2,2,3,3,d4 (δ 0,0 ppm) pour les spectres de matières grasses du lait. Les spectres RMN 1H de tous les échantillons ont été regroupés en régions intégrales de 0, 001 ppm et intégrés sur la région de 0, 5 à 7, 0 ppm à l'exclusion de l'eau (δ 4, 7 à 5, 12) à l'aide du progiciel AMIX (version 3.8.3, BrukerBiospin). Les spectres ont été normalisés à la somme totale des intégrales spectrales pour compenser les différences dans les concentrations des échantillons. Les matrices de données bidimensionnelles à partir des données de lactosérum et de matières grasses ont été intégrées dans un fichier Excel pour l'analyse SIMCA-P ultérieure.

Les fichiers de données brutes LC-MS (.wiff) ont été convertis au format mzXML à l'aide de ProteoWizard (http://metlin.scripps.edu/xcms/download/pwiz/pwiz.zip). Les fichiers ont été traités à l'aide d'un package open-source XCMS (version 1.20.1) dans le logiciel statistique R (version 2.10.0) pour la discrimination, le filtrage et l'alignement des pics38. Lors de la mise en œuvre de XCMS, le R-package CAMERA a été utilisé pour annoter les pics d'isotopes, d'adduits et d'ions produits. Les matrices bidimensionnelles résultantes, y compris les observations (noms d'échantillon) dans les colonnes, les variables (paires de temps de rétention m/z) dans les lignes et les zones de pic, ont été enregistrées sous forme de fichiers CSV. Le SI a été utilisé pour le contrôle de la qualité des données (reproductibilité) et la normalisation.

Les ensembles de données résultants ont ensuite été importés dans le progiciel SIMCA-P 13.0 (Umetrics AB, Umeå, Suède); La mise à l'échelle de Pareto et du centre a été appliquée aux données LC-MS et 1H RMN, respectivement, pour réduire le bruit et les artefacts dans les modèles. Une analyse en composantes principales (ACP) a été effectuée sur les données mises à l'échelle pour visualiser les tendances globales de regroupement et de séparation ou les valeurs aberrantes. Des modèles PLS-DA ont été appliqués pour valider le modèle contre le surajustement à travers 999 tests de permutation aléatoire. Les variables discriminantes ont été sélectionnées en fonction des diagrammes en S, de l'importance des variables dans les valeurs de projection (VIP > 1) et des diagrammes de données brutes dans les modèles OPLS-DA16,17,18. De plus, des tests t indépendants (P < 0,05) (SPSS version 13.0) ont été utilisés pour déterminer l'importance de chaque métabolite pour distinguer le groupe HS des groupes sans HS.

Pour analyser les corrélations entre les niveaux de tous les biomarqueurs potentiels découverts dans le lait avec leurs concentrations respectives dans le plasma rapportées précédemment à partir d'échantillons prélevés au même moment, des coefficients de corrélation partielle de Pearson ont été calculés à deux niveaux de confiance (0,01 et 0,001) en corrigeant de Groupe HS en premier ordre à l'aide du logiciel ParCorA téléchargeable sur http://mendes.vbi.vt.edu/tiki-index.php?page. Le cluster 3.0 et Treeview ont été utilisés séparément pour l'analyse de cluster et la visualisation, respectivement.

Les conditions d'élution du gradient chromatographique sont restées inchangées. L'éluant a été injecté dans un spectromètre de masse à triple piège quadripolaire équipé d'une source ESI (QTRAP 5500, Applied Biosystems/MDS Sciex). Tous les candidats potentiels découverts par LC-MS ont été détectés par UFLC-MS/MS en mode MRM. Pour chaque analyte d'intérêt, les énergies de collision et les paires d'ions précurseur/fragment ont été pré-optimisées pour générer un rapport signal/bruit optimal. Les transitions MRM sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S1.

Les cytokines, la protéine c-réactive et les concentrations de cytochrome c dans le plasma et le lait ont été analysées à l'aide de kits ELISA spécifiques aux bovins disponibles dans le commerce (Abcam®, Cambridge, MA, USA), conformément aux instructions des fabricants.

Comment citer cet article : Tian, H. et al. Étude métabolomique intégrée du lait de vaches laitières en lactation stressées par la chaleur. Sci. Rep. 6, 24208; doi : 10.1038/srep24208 (2016).

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Cette étude a été soutenue par le National Key Basic Research Program of China (Beijing, China; 2011CB100805), par le Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP-IAS12), par le Research System of the PR China (nycytx-04-01) , et par le projet financé par la China Postdoctoral Science Foundation (Pékin, Chine ; 2014M550907).

He Tian, Nan Zheng et Weiyu Wang : Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.

Institut des sciences animales, Académie chinoise des sciences agricoles, Pékin, 100193, République populaire de Chine

He Tian, Nan Zheng, Songli Li, Yangdong Zhang et Jiaqi Wang

Le lycée affilié à l'Université Renmin de Chine, Pékin, 100080, République populaire de Chine

Weiyu Wang

Collège des sciences et technologies animales, Université agricole d'Anhui, Hefei, 230036, République populaire de Chine

Jianbo Cheng

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JW a conçu et supervisé l'ensemble de l'étude. JW, HT, NZ et WW ont planifié les expériences ; JC, SL et YZ ont sélectionné des vaches laitières, collecté et fourni des échantillons de lait. HT a effectué l'analyse RMN et LC-MS, l'exploration de données et a rédigé le manuscrit. JW a révisé le manuscrit. JW, HT, NZ et WW ont élucidé les implications des résultats.

Correspondance à Jiaqi Wang.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Tian, H., Zheng, N., Wang, W. et al. Étude métabolomique intégrée du lait de vaches laitières en lactation stressées par la chaleur. Sci Rep 6, 24208 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24208

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Reçu : 13 janvier 2016

Accepté : 22 mars 2016

Publié: 06 avril 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep24208

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