Antagonisme pharmacologiquement ciblé des récepteurs NMDA par NitroMemantine pour les maladies cérébrovasculaires

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 14781 (2015) Citer cet article

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Un rectificatif à cet article a été publié le 12 février 2016

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Les accidents vasculaires cérébraux et la démence vasculaire sont les principales causes de morbidité et de mortalité. Des thérapies neuroprotectrices ont été proposées mais aucune ne s'est avérée cliniquement tolérée et efficace. Alors que l'on pense que la surstimulation des récepteurs du glutamate de type N-méthyl-d-aspartate (NMDAR) contribue aux insultes cérébrovasculaires, l'importance des NMDAR dans la fonction physiologique a fait de cette cible, du moins de l'avis de beaucoup de «Big Pharma», « indroguable » pour cette indication. Ici, nous décrivons de nouveaux médicaments NitroMemantine, comprenant une fraction adamantane qui se lie dans le canal ionique associé au NMDAR qui est utilisé pour cibler un groupe nitro sur les sites régulateurs à médiation redox sur le récepteur. Les NitroMemantines sont à la fois bien tolérées et efficaces contre l'infarctus cérébral chez les modèles de rongeurs via un double mécanisme allostérique de blocage des canaux ouverts et de modulation NO/redox du récepteur. La S-nitrosylation ciblée des NMDAR par la nitromémantine est potentialisée par l'hypoxie et ainsi dirigée vers les neurones ischémiques. Les approches allostériques pour ajuster l'activité NMDAR peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour les troubles cérébrovasculaires.

L'ischémie cérébrale focale (accident vasculaire cérébral) et la démence vasculaire (due à de multiples accidents vasculaires cérébraux dans la microvasculature) représentent les principales causes de dysfonctionnement cognitif grave et de décès dans le monde1. Alors que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate de type N-méthyl-d-aspartate (NMDAR) est reconnue comme étant importante dans l'étiologie des lésions cérébrovasculaires2,3, les antagonistes des NMDAR se sont révélés auparavant inefficaces ou cliniquement intolérables pour les atteintes ischémiques cérébrales chez l'homme malgré des résultats précoces prometteurs dans des modèles animaux4,5,6. Beaucoup de «Big Pharma» ont donc fait l'hypothèse tacite que les NMDAR ne sont pas «médicamentables» pour les atteintes cérébrovasculaires. Cependant, il est possible qu'au lieu que la cible soit intraitable, les antagonistes spécifiques utilisés n'aient pas été conçus de manière adéquate. Les données présentées ici soutiennent la prémisse selon laquelle le cas des antagonistes du NMDAR devrait être réexaminé.

Un concept important relativement nouveau concerne la population de NMDAR qui sont activés de manière excessive au cours de l'ischémie cérébrale et de la démence vasculaire. Des preuves récentes soutiennent l'idée que dans la plupart des conditions, l'activité pathologique est principalement médiée par les NMDAR extrasynaptiques, alors que l'activité NMDAR synaptique physiologique déclenche des voies moléculaires neuroprotectrices dans les neurones7,8. Un antagoniste NMDAR bien étudié en particulier, la mémantine9, représente un médicament non compétitif/rapide ('UFO'), qui affecte principalement les NMDAR extrasynaptiques/toniquement activés par rapport aux NMDAR synaptiques/phasiquement activés10,11,12,13. En fait, la mémantine s'est révélée prometteuse non seulement dans les études sur les accidents vasculaires cérébraux chez l'animal, mais également dans un essai clinique de phase 2 sur l'homme pour son efficacité dans la démence vasculaire14,15,16,17. Néanmoins, malgré son approbation par la FDA et l'EMA pour la maladie d'Alzheimer modérée à sévère, le médicament n'a pas été testé dans des essais avancés supplémentaires pour la maladie ischémique en raison de ses effets assez modestes. Ici, nous développons et caractérisons des analogues améliorés de la mémantine, représentant des nitrates d'aminoadamantane qui démontrent à la fois une efficacité et une sécurité accrues dans des modèles animaux d'ischémie cérébrale. Il est important de noter que la démonstration détaillée de la sélectivité ciblée, des propriétés électrophysiologiques et des effets neurocomportementaux du candidat principal, désigné YQW-036/NMI-6979 NitroMemantine18,19, fournit un profil thérapeutique prometteur. Les premières études pharmacocinétiques indiquent également que ce médicament pourrait représenter un candidat viable pour les maladies liées à l'ischémie cérébrale.

Nous montrons ici que les NitroMemantines offrent un avantage sur la mémantine, au moins en partie, parce que les nouveaux médicaments manifestent un double site d'action au niveau du NMDAR ; par conséquent, NitroMemantine agit de manière supérieure à la mémantine dans le traitement d'un modèle de rat de maladie cérébrovasculaire focale. Le fragment mémantine, qui bloque préférentiellement les canaux exploités par NMDAR excessivement ouverts dans les neurones subissant une insulte ischémique, est utilisé pour cibler un groupe générateur de NO vers les sites modulateurs redox de ces NMDAR ; ces sites redox subissent ensuite une S-nitrosylation pour provoquer une désensibilisation des canaux, ce qui entraîne une double action des médicaments NitroMemantine via un blocage des canaux couplé à une modulation redox allostérique11,18,20. Les résultats montrent que la NitroMemantine offre significativement plus de protection que la mémantine contre les agressions ischémiques cérébrales, tout en épargnant une plus grande proportion de la transmission synaptique. Peut-être le plus important, NitroMemantine est un exemple de médicament approuvé par la FDA (mémantine) qui est utilisé pour cibler une seconde fraction vers le même récepteur afin d'améliorer l'efficacité de l'action. Ce principal peut servir de nouvelle plate-forme pour la découverte de médicaments cliniquement tolérés dans le SNC.

Nous avons précédemment montré que le NMDAR peut être antagonisé par la mémantine via un bloc à canal ouvert10,14 ainsi que par des composés à base d'oxyde nitrique (NO) via un ou plusieurs sites modulateurs redox allostériques soumis à la S-nitrosylation20,21 ,22. De plus, nous avons démontré que la mémantine interagit préférentiellement avec les canaux associés au NMDAR excessivement (pathologiquement) ouverts11,13. De plus, pendant l'hypoxie, les composés à base de NO réagissent préférentiellement avec les résidus de cystéine allostériques dans le NMDAR pour limiter l'activité excessive22. Dans un effort pour combiner ces attributs et produire un médicament à double fonction qui cible le groupe NO sur des canaux couplés NMDAR pathologiquement ouverts, nous nous sommes "adossés" à la mémantine d'un groupe NOx (où x = 1 ou 2). À cette fin, nous avons initialement synthétisé plusieurs centaines de dérivés de NitroMemantine (et des échafaudages de contrôle) afin d'effectuer une relation structure-activité (SAR) détaillée de ces nouveaux médicaments19. Parmi ceux-ci, une série de médicaments s'est révélée particulièrement prometteuse et possédait un groupe nitro (-NO2) opposé à l'amine tête de pont (-NH2), qui est protonée (-NH3 +) à pH physiologique (Fig. 1a; voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails sur la chimie synthèse)18. Nous avons précédemment montré que, via cette amine tête de pont, la mémantine se lie au niveau ou à proximité du site Mg2+ du NMDAR, en particulier sur la sous-unité GluN1 (précédemment désignée par NR1)23.

Blocage des canaux des courants médiés par NMDAR par divers médicaments aminoadamantane.

(a) Structure de l'aminoadamantane et des nitrates d'aminoadamantane. Le chlorhydrate de 1-aminoadamantane (mémantine) possède des chaînes latérales méthyle (groupes « R ») et ne contient pas de groupe nitro à l'arrière de la molécule. Avec l'ajout du groupe nitro pour la fonctionnalité redox, l'affinité de la fraction aminoadamantane pour le canal ionique associé au NMDAR est diminuée. Cependant, l'allongement des chaînes latérales «R» compense cela. Alors que la mémantine et YQW-035 ont des chaînes latérales méthyle, YQW-012 n'a que des protons, YQW-036 a des groupes éthyle et YQW-037, des groupes propyle. Non seulement l'allongement des chaînes latérales augmente l'affinité de liaison dans le canal, mais augmente également la lipophilicité et donc la pénétrance de la barrière hémato-encéphalique, tout en diminuant la solubilité aqueuse. ( b ) L'amantadine (10 μM) a inhibé moins de courant NMDA à l'état d'équilibre que la mémantine équimolaire. La nitromémantine équimolaire YQW-035 manifeste moins de blocage des canaux que la mémantine mais plus que l'amantadine. En revanche, NitroMemantine YQW-036 bloque les canaux à l'état d'équilibre d'environ le même degré que la mémantine. Pince de tension à deux électrodes d'ovocytes exprimant des récepteurs recombinants GluN1/GluN2A à un potentiel de maintien (Vh) -70 mV. Les valeurs sont moyennes + sem (c) Dose-réponse de NitroMemantine YQW-035 à Vh = -70 mV. Les valeurs sont moyennes ± sem (d) Dose-réponse de NitroMemantine YQW-036 à Vh = -70 mV. Les valeurs sont moyennes ± sem (e) Dans les neurones corticaux primaires de rat, des enregistrements de patch-clamp de cellules entières ont révélé que 5 μM de mémantine ou de nitromémantine YQW-036 produisaient un degré de blocage approximativement équivalent à -75 mV et moins de blocage à +30 mV, indiquant la dépendance vis-à-vis de la tension du bloc par le fragment mémantine. Dans l'histogramme, pour chaque point de données, n ≥ 5 enregistrements par drogue testée ; barre de gauche dans chaque paire pour les réponses à -75 mV et barre de droite pour les réponses à +30 mV. Les valeurs sont moyennes + sem

Nous avons étudié en détail un certain nombre de ces composés NitroMemantine, qui utilisent le site de liaison de la mémantine à haute affinité sur les NMDAR pour cibler le groupe NOx pour une interaction avec le site de S-nitrosylation/redox externe au site de liaison de la mémantine. En particulier, nous avons constaté qu'en ajoutant le groupe fonctionnel -ONO2 de la nitroglycérine à la mémantine (représentée par le composé YQW-035), nous réduisions la puissance du blocage des canaux à l'état d'équilibre lors des enregistrements électrophysiologiques d'ovocytes de grenouille exprimant des NMDAR recombinants (Fig. 1b) . Nous avons constaté qu'en allongeant les chaînes latérales de la mémantine, nous pouvions compenser la perte d'affinité médicamenteuse dans le canal associée à l'ajout du groupe -ONO2. YQW-036 (avec des groupes éthyle) représente la longueur de chaîne latérale préférée, car YQW-037 (avec des groupes propyle) ne peut pas être dissous dans des solutions aqueuses. L'IC50 de l'inhibition du courant induit par le NMDA pour les ajouts à court terme de YQW-35 (qui a des groupes latéraux méthyle similaires à la mémantine) et de YQW-36 (dans lequel les groupes latéraux ont été allongés en éthyle) est de 6,3 et 2,4 μM, respectivement , lorsqu'il est mesuré dans des conditions d'état d'équilibre après une addition de médicament à court terme lors d'enregistrements de tension à un potentiel de maintien de -70 mV (Fig. 1c, d). Ces valeurs peuvent être comparées à l'IC50 de la mémantine (0,5–1 μM) et de l'amantadine (~35 μM)10,24. Ainsi, le médicament NitroMemantine désigné YQW-036 manifeste une affinité pour le canal ionique exploité par NMDAR se rapprochant de celle de la mémantine. Alors que ces valeurs ont été obtenues en l'absence nominale de Mg2+ extracellulaire, nous avons montré que YQW-036 bloque également les courants évoqués par le NMDA en présence de concentrations normales de Mg2+ (Fig. 1 supplémentaire).

De plus, ces nouveaux composés, comme la mémantine, affichent une inhibition dépendante de la tension des courants évoqués par le NMDA dans les enregistrements de neurones cérébrocorticaux de rat, comme prévu pour un bloqueur de canal ouvert chargé positivement (Fig. 1e). Cependant, cette propriété peut expliquer en partie l'efficacité clinique relativement faible de la mémantine. Lorsque les neurones deviennent énergétiquement compromis et par conséquent se dépolarisent en raison de l'afflux d'ions Na+ et Ca2+ chargés positivement25,26, la mémantine est repoussée du canal ionique. Ainsi, les neurones « les plus malades », qui ont le plus besoin de neuroprotection, deviennent vulnérables.

Pour tenter de remédier à cette lacune, les adduits de NitroMemantine manifestent une seconde inhibition basée sur l'oxydo-réduction du courant induit par le NMDA. Ce site d'action allostérique supplémentaire produit une inhibition relativement durable des NMDAR résultant de la S-nitrosylation qui est médiée par le groupe nitro, comme le démontrent les enregistrements d'ovocytes voltage-clampés (Fig. 2a)20,27,28. Contrairement au blocage des canaux par la fraction mémantine, ce deuxième effet allostérique nécessite plusieurs minutes d'ajout de médicament pour le début de l'action (et n'est donc pas évident dans les ajouts à court terme de la Fig. 1) et survit à l'élimination de plusieurs minutes20,27,28. Pour s'assurer que NitroMemantine n'avait pas pénétré dans le canal pendant la période de lavage, par opposition à l'ajout ultérieur d'agonistes comme prévu d'un bloqueur de canal ouvert, nous avons analysé les temps de montée des réponses individuelles évoquées par le NMDA avant et après l'ajout de YQW-036 ; nous avons constaté que les temps de montée étaient similaires (encart sur la Fig. 2c), comme prévu si l'antagoniste ne résidait pas déjà dans le canal, c'est-à-dire piégé, avant l'ajout de l'agoniste10,29. Nous pouvons en outre distinguer l'effet redox du groupe nitro du bloc canal du noyau aminoadamantane de deux manières supplémentaires. Premièrement, l'effet de la S-nitrosylation est abrogé par la mutation systématique de cinq résidus cystéine (Fig. 2b). Il est important de noter que des travaux antérieurs ont montré que la mutation de ces mêmes résidus de cystéine n'affecte pas les autres propriétés du NMDAR, y compris l'inhibition au niveau du site de liaison Mg2+/mémantine dans le canal20,30. Notez également que dans des conditions d'air ambiant, comme testé ici, la majorité de l'effet est médiée par Cys399 sur la sous-unité GluN2A (précédemment désignée NR2A). Cependant, comme démontré précédemment22, l'inhibition par le groupe nitro est nettement augmentée dans des conditions hypoxiques liées à l'AVC et à la démence vasculaire ; dans ces conditions, quatre autres résidus cystéine dans GluN1 et GluN2 contribuent à l'effet de S-nitrosylation. Deuxièmement, la S-nitrosylation, contrairement au blocage des canaux, peut être prévenue par une incubation préalable avec une petite molécule, un agent réactif au sulfhydryle comme le méthanethiosulfonate d'éthylammonium (MTSEA), qui réagit avec les mêmes résidus de cystéine et bloque ainsi l'effet du groupe nitro (Fig. 2c–e).

Effets redox de NitroMemantine YQW-036 médiés par la S-nitrosylation.

( a ) Enregistrements représentatifs sous pince de tension à deux électrodes dans des ovocytes exprimant des sous-unités NMDAR mutantes de cystéine de type sauvage (WT) ou non nitrosylables. ( b ) Quantification de la contribution des résidus de cystéine dans diverses sous-unités NMDAR à l'effet inhibiteur de la S-nitrosylation (les données sont moyennes + sem pour n ≥ 5 enregistrements par point de données, ** P <0, 01). ( c ) Dans les enregistrements d'ovocytes de courants évoqués par le NMDA sous voltage clamp, l'inhibition par la nitromémantine (10 μM) a largement occulté tout effet supplémentaire de l'application ultérieure du réactif sulfhydryl-réactif MTSEA (0, 5 mM), comme prévu si les mêmes résidus de cystéine étaient impliqué. Encart : échelle de temps étendue pour montrer le temps de montée du courant évoqué par le NMDA avant et après l'ajout de NitroMemantine. ( d ) L'inhibition des courants évoqués par le NMDA par le MTSEA bloque l'effet inhibiteur à médiation redox de l'ajout ultérieur de NitroMemantine. (e) Quantification des effets indiqués en c et d. Les données sont moyennes + sem pour n ≥ 6 enregistrements d'ovocytes par point de données (* P < 0,005). (f) NitroMemantine inhibe l'activité NMDAR par S-nitrosylation. L'ajout de 100 μM de nitromémantine YQW-036, mais pas de son métabolite mémantine-OH, a inhibé le courant évoqué par le NMDA dans les ovocytes exprimant les NMDAR GluN1 / GluN2A enregistrés dans des conditions de tension imposées utilisées pour observer la S-nitrosylation (Vh = -60 mV; données représentatives de n ≥ 4 enregistrements d'ovocytes). ( g ) La mutation du site de liaison de la mémantine dans la sous-unité GluN1 du NMDAR empêche l'effet redox de la nitromémantine. La perturbation du site de liaison de la mémantine par la mutation GluN1 (N616R) a abrogé l'activité à médiation redox de la nitromémantine (100 μM). Données représentatives de n ≥ 3 enregistrements d'ovocytes.

La liaison de la mémantine dans le canal associé au NMDAR est largement abrogée par une mutation au niveau ou à proximité du site Mg2+, par exemple, dans les NMDAR avec une composition de sous-unités GluN1(N616R)/GluN223,31. Nous avons testé la capacité de la structure centrale de l'aminoadamantane à cibler les NOx vers les sites de S-nitrosylation/redox externes au site de liaison à la mémantine dans le canal en mutant le site de liaison à la mémantine. Étant donné que la mutation du canal a provoqué des courants plus faibles que ceux des NMDAR de type sauvage (WT), il était nécessaire dans ces expériences d'utiliser des concentrations relativement élevées (par exemple, 100 μM) de NitroMemantine afin d'augmenter l'ampleur de l'effet. Nous avons comparé notre principal médicament NitroMemantine, YQW-036, à l'échafaudage 1-amino-3′,5′-diéthyl-7-hydroxy-adamantine sans le groupe nitro (désigné ici par mémantine-OH)18,19. Nous avons constaté que la mutation du site de liaison de la mémantine supprimait largement l'activité des NitroMemantines (Fig. 2f, g et Fig. 2 supplémentaire), alors qu'une concentration élevée du donneur de NO S-nitrosocystéine (SNOC) inhibait à la fois le WT et les NMDAR mutants ( Figure supplémentaire 2). Ces résultats indiquent que le groupement central aminoadamantane peut cibler le groupe nitro vers le récepteur; la mutation du site de liaison de l'aminoadamantane a empêché ce ciblage.

Pour confirmer davantage ce ciblage, nous avons effectué des tests de commutation de la biotine pour mesurer les protéines S-nitrosylées après l'administration systémique de NitroMemantine YQW-036 chez des rats subissant un AVC. La nitromémantine, mais pas la mémantine, a entraîné une augmentation significative de la S-nitrosylation de la sous-unité GluN1 du NMDAR (formant SNO-GluN1) dans le parenchyme cortical ipsilatéral mais non contralatéral à l'AVC (Fig. 3). En revanche, la S-nitrosylation d'autres protéines dont nous avons montré qu'elles étaient nitrosylées de manière aberrante au cours de la neurodégénérescence, par exemple la protéine 1 liée à la dynamine (Drp1), n'étaient pas significativement affectées par la NitroMemantine. Cette expérience montre le ciblage pharmacodynamique du groupe nitro par NitroMemantine aux NMDARs au site de l'insulte physiopathologique.

La S-nitrosylation est ciblée sur le NMDAR par NitroMemantine.

( a ) Des rats spontanément hypertendus (SHR) ont reçu une dose de charge de solution saline, de véhicule, de mémantine (Mem) ou de nitromémantine (NitroMem) 2 heures après l'occlusion, puis ont été sacrifiés 90 minutes plus tard. Des lysats cérébraux ont été préparés et des tests de biotine ont été effectués pour détecter SNO-GluN1 et SNO-Drp1 des hémisphères ipsilatéral (AVC) et controlatéral (sans AVC). ( b ) Les niveaux de protéine SNO sont présentés comme le rapport des résultats ipsilatéral à controlatéral au-dessus de la valeur de contrôle de base (moyenne + sem; n ≥ 4 pour chaque valeur, * P <0, 03 par rapport au contrôle par test t).

La plupart des antagonistes NMDAR produisent des anomalies neurocomportementales en bloquant la neurotransmission normale; cependant, la mémantine ne présente pas ces effets secondaires9,11,12,32,33. Auparavant, nous avions testé des médicaments à base de mémantine et de nitromémantine sur la préparation d'autapse de l'hippocampe de rat et sur des neurones corticaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) et montré qu'ils bloquaient préférentiellement les réponses médiées par le NMDAR extrasynaptique, qui contribuaient à la neurodégénérescence7,13,18. Nous avons signalé que l'ajout à long terme de NitroMemantine était plus efficace que la mémantine équimolaire à cet égard18. Ici, nous montrons que NitroMemantine YQW-036 (10 μM) a épargné l'activité synaptique physiologique dans une plus grande mesure que la mémantine (Fig. 4a – c). De plus, NitroMemantine a épargné la potentialisation à long terme (LTP) (Fig. 4d, e), représentant une augmentation des courants synaptiques en réponse à des entrées synaptiques répétées, ce qui est considéré comme un corrélat électrique de l'apprentissage et de la mémoire. De plus, comme pour la mémantine34, le labyrinthe aquatique de Morris, un test neurocomportemental pour l'apprentissage spatial et la mémoire, n'a pas été affecté par des doses neuroprotectrices de NitroMemantine (Fig. 4f)18,19,35.

Absence d'effet de la NitroMemantine sur les EPSC, le LTP et le labyrinthe aquatique de Morris.

( a ) Enregistrements de cellules entières d'EPSC évoqués à partir d'autapses hippocampiques. Le composant médié par NMDAR de l'EPSC a été bloqué dans une moindre mesure par 10 μM NitroMemantine YQW-036 que par 10 μM mémantine. Le composant AMPA de l'EPSC a été bloqué avec 20 μM de CNQX. En tant que contrôle, 50 μM (2R)-amino-5-phosphonopentanoate (d-AP5), un antagoniste compétitif du site de liaison du glutamate, ont complètement bloqué le composant NMDAR de l'EPSC. ( b ) Le degré de blocage de l'EPSC n'a pas augmenté de manière significative avec une stimulation électrique répétée (impulsions 1 à 10) en présence de NitroMemantine YQW-036. ( c ) L'effet inhibiteur de la mémantine était dépendant de l'utilisation, le 10e EPSC déclenché étant plus bloqué que le 1er. Par conséquent, la mémantine équimolaire bloque la neurotransmission à un degré plus élevé que la nitromémantine. Pour chaque panel, les données sont représentatives de n ≥ 4 enregistrements patch-clamp. ( d ) La dose neuroprotectrice de NitroMemantine (NitroMem, 10 μM) n'a pas inhibé la LTP dans l'hippocampe CA1 induite par un éclatement à haute fréquence dans des tranches d'hippocampe de rat. ( e ) En tant que contrôle dans les expériences LTP, MK-801 (équimolaire, 10 μM) a complètement inhibé l'induction LTP (n ≥ 4 tranches pour les panneaux d et e). (f) Absence d'effet de NitroMemantine sur les performances du labyrinthe d'eau Morris. Test de labyrinthe aquatique de rats mâles adultes spontanément hypertendus (SHR) traités avec NitroMemantine ou véhicule. Les rats ont été acclimatés au labyrinthe aquatique le jour 1, puis testés les 4 jours suivants, avec 6 essais/jour pour un total de 24 essais. La position de la plate-forme était modifiée chaque jour et les points de libération pour chaque essai variaient de manière pseudo-aléatoire. Toutes les valeurs sont moyennes ± sem ; n = 5 pour chaque groupe. Les pics aux essais 7 et 13 représentent le résultat du premier essai aux jours 2 et 3 du test et indiquent que les animaux ont montré un certain degré d'« oubli » pour la tâche pendant la nuit et ont dû réapprendre. Au jour 4 (essai 19), les animaux ont appris plus rapidement la nouvelle position de la plate-forme.

Une autre préoccupation bien connue concernant les antagonistes NMDAR est leur propension à provoquer des lésions histologiques dans certaines régions du cerveau. Par exemple, les antagonistes NMDAR de haute affinité comme le MK-801 provoquent l'apoptose neuronale, en particulier dans le cerveau en développement du rongeur36,37. Cependant, nous avons constaté que ni la mémantine ni la nitromémantine n'induisaient l'apoptose neuronale dans le cortex cérébral en développement à une dose cliniquement pertinente (Fig. 3 supplémentaire).

Ensuite, nous avons testé la capacité du principal médicament NitroMemantine YQW-036 par rapport à la mémantine à offrir une neuroprotection en utilisant un modèle de rat d'ischémie cérébrale focale consistant en une occlusion/reperfusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO/R), un modèle que nous et d'autres avons détaillé auparavant34,38,39,40. Notez que nous avons délibérément choisi un modèle très sévère de maladie cérébrovasculaire tel que ces animaux mouraient en moins de deux jours s'ils n'étaient pas traités ; par conséquent, pour permettre la comparaison, les animaux traités et non traités ont été évalués à la fois sur le plan comportemental et histologique un jour après l'AVC. Initialement, nous avons testé une dose-réponse complète de la concentration du médicament et du temps de délivrance après l'insulte afin d'obtenir une fenêtre thérapeutique post-AVC. Pour obtenir une neuroprotection significative, nous avons constaté que nous pouvions retarder le traitement jusqu'à deux (mais pas trois) heures après l'occlusion en utilisant les doses maximales réalisables (MFD). Par conséquent, pour les présentes expériences, nous avons utilisé le MFD précédemment déterminé pour la mémantine comme dose de charge (90,3 μmol/kg ou 20 mg/kg)14,34, administrée par voie intrapéritonéale (ip) au moment de la reperfusion (c'est-à-dire 2- h après l'occlusion). Pour NitroMemantine, seulement ~ 70 % de cette dose de charge a été injectée (65,8 μmol/kg) en raison des limites de solubilité du médicament. Par la suite, la dose d'entretien standard de 4,63 μmol/kg (1 mg/kg) de mémantine a été administrée toutes les 12 h14,34, tandis que la dose de NitroMemantine a été maintenue à 70 % (3,29 μmol/kg) de la dose d'entretien de mémantine. Les deux médicaments offraient un degré significatif de protection histologique après ischémie focale (Fig. 5a). Cependant, il est important de noter que seule la NitroMemantine a produit une amélioration des tests neurocomportementaux fonctionnels affectant les performances motrices, même si le MFD de la NitroMemantine était inférieur au MFD de la mémantine (Fig. 5b). (Remarque : les paramètres physiologiques, y compris les températures crâniennes et rectales, la pression artérielle et le panel métabolique, n'ont pas été significativement affectés par la dose de charge de mémantine ou de nitromémantine (tableau supplémentaire 1)).

Protection et mécanisme d'action de la nitromémantine.

( a ) La nitromémantine et la mémantine offrent une protection histologique dans le modèle tMCAO / R du rat. Des doses de charge de médicament (ou de solution saline témoin) ont été administrées 2 h après l'occlusion, des doses d'entretien 12 h plus tard et les animaux ont été sacrifiés à 24 h. Gauche : Une dose plus faible de YQW-036 (voir texte) protège davantage que la mémantine, comme évalué par la coloration au chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium (TTC) (*P < 0,05 par ANOVA avec posthoc Scheffé ). À droite : sections cérébrales coronales représentatives colorées au TTC dans le cadre de chaque protocole de traitement. (b) La nitromémantine, mais pas la mémantine, a montré un effet protecteur sur les tests neurologiques/comportementaux objectifs (voir Procédures expérimentales, * P <0, 05 par ANOVA avec Scheffé posthoc). Nombre de rats spontanément hypertendus (SHR) testés dans les panels a et b : n = 9 pour le groupe solution saline ; n = 4 pour le groupe traité à la mémantine ; n = 5 pour le groupe traité à la nitromémantine. ( c ) Le traitement à la nitromémantine a réduit la taille de l'infarctus par rapport à la mémantine, à la mémantine-OH et aux témoins de véhicule (** P <0, 01 par ANOVA avec Scheffé posthoc). Nombre de SHR testés : n = 13 pour le groupe solution saline ; n = 10 pour le groupe traité à la mémantine ; n = 8 pour le groupe traité à la nitromémantine ; n = 7 pour le groupe traité à la mémantine-OH. Les valeurs sont moyennes ± sem pour chaque panel. (d) Schéma de l'action NitroMemantine. Le fragment adamantane fournit une livraison ciblée d'un groupe NOx (où x = 1 ou 2) au NMDAR, fournissant deux sites d'action antagoniste. Premièrement, un adamantane, tel que la mémantine, pénètre et se lie préférentiellement aux canaux couplés NMDAR excessivement ouverts. Deuxièmement, un groupe NOx réagit avec le ou les sites redox, constitués de groupe(s) thiol réactif(s), en dehors du champ de tension du canal (modifié par rapport à la réf. 12).

Ensuite, afin de permettre une comparaison directe, nous avons testé des concentrations équimolaires de mémantine, NitroMemantine et son produit de dégradation, mémantine-OH, en utilisant le MFD de NitroMemantine. Nous avons observé que la mémantine et la mémantine-OH n'offraient aucune protection significative à ce dosage, alors que la nitromémantine offrait un bénéfice significatif sur l'analyse histologique (Fig. 5c). Pris ensemble, ces résultats sont cohérents avec l'idée que la nitromémantine offre un résultat supérieur à la mémantine pour les atteintes cérébrovasculaires focales et que cet avantage supplémentaire peut être attribuable à l'administration ciblée du groupe nitro, permettant une meilleure régulation allostérique du NMDAR.

Dans la présente étude, nous décrivons le mécanisme d'action de NitroMemantine, qui fournit un antagonisme à double site régulé par l'hypoxie au NMDAR (Fig. 5d). Les caractéristiques de NitroMemantine qui peuvent conférer un bénéfice dans les neurones ischémiques sont multiples : 1. Blocage dépendant de la tension des canaux NMDAR excessivement ouverts, principalement extrasynaptiques ; 2. Livraison ciblée du groupe nitro aux NMDAR par l'échafaudage mémantine; et 3. Régulation allostérique de la S-nitrosylation du canal par hypoxie. Le ciblage du groupe nitro se produit probablement parce que les bloqueurs de canaux ouverts passent une proportion accrue de leur temps près de l'embouchure du canal, augmentant ainsi les chances statistiques du groupe nitro de réagir avec les résidus de cystéine vicinaux. NitroMemantine module ainsi le paramètre biophysique de "gain" d'activité du canal en fournissant deux "contrôles de volume" allostériques sur le NMDAR41, représentés par l'action de la mémantine dans le canal et la S-nitrosylation à l'extérieur de celui-ci. De cette manière, une activité NMDAR extrasynaptique excessive peut être plus efficacement régulée à la baisse par la nitromémantine que par la mémantine seule11,18,20,23,32.

Comment la S-nitrosylation du canal se produit précisément n'est pas claire. Les nitrates d'alkyle tels que NitroMemantine ne nitrosent pas directement et ne libèrent pas spontanément de NO. Cependant, ils formeront des thionitrates en réaction avec des thiols qui peuvent se réarranger pour former des sulfénylnitrites nitrosants. De plus, le réseau de cystéine dans le récepteur peut faciliter la chimie réductrice requise21,27,42. En définitive, le site d'action du groupement nitro étant extérieur au champ de tension du canal, la contribution redox à l'antagonisme NMDAR ne diminue pas lorsque le neurone se dépolarise20,22,28. Ainsi, NitroMemantine peut réguler négativement l'activité NMDAR excessive à un point où la mémantine seule perdrait son efficacité.

On pourrait s'attendre à ce que le groupe nitro soit ciblé sur le NMDAR uniquement pendant les périodes de blocage du canal ouvert par le fragment aminoadamantane, c'est-à-dire en présence d'agoniste. Fait intéressant, cependant, nous avons observé un effet à médiation redox des nitromémantines même lorsque le médicament était ajouté pendant une période prolongée entre les applications de l'agoniste NMDA. Ces résultats sont compréhensibles sur la base de la chimie physique connue des aminoadamantanes, qui ont un coefficient de partage lipide-eau très élevé (voir les informations supplémentaires dans la réf. 35 et les citations qui y sont contenues). Notre diminution observée de la solubilité dans l'eau de la nitromémantine par rapport à la mémantine montre que la lipophilie est encore augmentée lorsque le groupe nitro est ajouté. Ainsi, les nitrates d'aminoadamantane semblent rester dans la membrane lipidique comme un réservoir, prêt à pénétrer dans le canal dès son ouverture et à déclencher également l'effet redox35. Nous pouvons voir que YQW-036 n'est pas entré dans le canal avant l'application du NMDA en raison du temps de montée similaire des courants induits par l'agoniste avant et après l'application de l'antagoniste (Fig. 2c, encadré). Si le nitrate d'aminoadamantane était déjà dans le canal avant l'application du NMDA (c'est-à-dire piégé dans le canal fermé), il serait lentement sorti immédiatement après l'application de l'agoniste, produisant un temps de montée plus lent du courant évoqué par le NMDA. De plus, lorsqu'une concentration élevée de YQW-036 a été utilisée (100 μM plutôt que 1 à 10 μM), l'effet lipophile du médicament a été encore amplifié, comme en témoigne le lent lavage d'un composant de l'effet inhibiteur lors d'agonistes répétés. applications (Fig. 2f). Néanmoins, le fait que l'effet prolongé de YQW-036 ait été largement abrogé par l'ajout préalable de MTSEA ou la mutation de cystéines redox-actives dans le NMDAR indique que cette composante de l'action inhibitrice du médicament ne peut être attribuée uniquement à une lipophilie accrue. Au contraire, la composante majeure de l'effet inhibiteur prolongé de YQW-036 s'explique mieux par l'interaction au(x) site(s) redox sur le NMDAR, car elle a été empêchée par des interventions chimiques et moléculaires au niveau des résidus de cystéine qui sous-tendent la modulation redox du récepteur20 . De plus, la découverte que la mutation du site de liaison principal du fragment aminoadamantane dans le canal (GluN1 (N616R)) a largement abrogé l'effet inhibiteur prolongé de YQW-036 (Fig. 2g) est cohérente avec l'idée que l'action de type mémantine du médicament sert à cibler le groupe nitro vers le récepteur. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité supplémentaire que la S-nitrosylation par NitroMemantine augmente également la sensibilité du récepteur au blocage des canaux via le fragment adamantane. De plus, les propriétés lipophiles des nitrates d'aminoadamantane devraient être cliniquement bénéfiques en ce qu'elles augmentent la concentration de médicament traversant la barrière hémato-encéphalique ; en fait, en raison de leur lipophilie, il a été rapporté que les aminoadamantanes étaient concentrés au moins 20 fois dans le cerveau par rapport aux niveaux plasmatiques (voir les citations dans la réf. 35).

Nous avions précédemment publié des preuves que la mémantine ne s'accumule pas dans les canaux synaptiques associés au NMDAR en raison, au moins en partie, de son taux de désactivation relativement rapide ; par conséquent, la mémantine n'affecte pas négativement la composante médiée par le NMDAR des courants post-synaptiques excitateurs (EPSC), l'induction dépendante du NMDAR de la LTP ou les tests comportementaux tels que le labyrinthe d'eau de Morris10,23,32. On pense que le fait que la mémantine épargne principalement l'activité synaptique/phasique tout en bloquant les NMDAR extrasynaptiques/toniquement actifs est à la base de sa tolérabilité clinique et de son efficacité clinique raisonnable dans les essais cliniques humains11,12,13. Par conséquent, notre découverte selon laquelle NitroMemantine épargne encore plus d'activité synaptique tout en antagoniste de l'activité extrasynaptique à un degré encore plus élevé que la mémantine peut expliquer l'efficacité accrue du nouveau médicament et est de bon augure pour sa tolérance clinique dans les tests humains18. De plus, la potentialisation hypoxique de l'inhibition des récepteurs, comme on le voit avec les composés à base de NO22, est une caractéristique particulièrement souhaitable dans l'ischémie. Ainsi, les antagonistes NMDAR régulés par l'hypoxie et ciblés allostériquement, bien que de faible affinité, peuvent être prometteurs pour les troubles cérébrovasculaires et autres troubles neurodégénératifs18,19.

Tous les protocoles d'utilisation d'animaux vertébrés ont été approuvés par le Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute IACUC et toutes les expériences ont suivi les directives de l'ARAC. D'autres méthodes et toutes les références associées se trouvent dans la version en ligne du document.

Nous avons synthétisé des nitrates d'adamantane en utilisant des réactions publiées. Les schémas et procédures synthétiques sont décrits dans les méthodes supplémentaires.

Des enregistrements de pince de tension à deux électrodes à -60 ou -70 mV ont été effectués sur des ovocytes dans une solution de Ringer de grenouille deux à sept jours après l'injection de sous-unités NMDAR. Les enregistrements ont été effectués avec un amplificateur Oocyte Clamp OC-725b (Warner Instrument Corporation, Hamden, CT) en utilisant le logiciel MacLab version 3.5 (AD Instruments, Milford, MA) à température ambiante. Les électrodes d'injection de courant avaient une résistance de 0,5 à 1 MΩ et les électrodes de détection de tension avaient une résistance de 1 à 4 MΩ. Les deux électrodes ont été remplies de 3 M KCl. Une solution contenant 90 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 10 mM d'HEPES, 1,5 mM de BaCl2 et 10 à 100 μM de glycine, pH 7,5 a été utilisée pour superfuser en continu les ovocytes. Le baryum, plutôt que le calcium, a été utilisé comme cation divalent afin de minimiser l'activation secondaire du courant Cl− activé par Ca2+. Dans certaines expériences, 1,2 mM de MgCl2 a été ajouté à la solution du bain. Les médicaments ont été dissous dans une solution de ringer de grenouille et appliqués par superfusion à un débit de 2 ml/min. Dans certains cas, pour obtenir un échange de solution relativement rapide, nous avons utilisé un réseau de pipettes similaire au système de "tuyau d'égout" utilisé dans l'enregistrement patch-clamp44. Les artefacts de perfusion ont été numériquement supprimés des traces.

Des méthodes établies ont été utilisées pour préparer des cultures primaires de cortex cérébral de rat et des cultures autaptiques d'hippocampe45,46,47. En bref, pour les cultures corticales de rat, les cortex cérébraux ont été disséqués à partir de rats Sprague-Dawley du jour embryonnaire 16-17 (E16-17). Après dissociation, les cellules ont été étalées sur des boîtes revêtues de poly-l-lysine dans du DMEM plus F12 de Ham et du sérum de veau additionné de fer inactivé à la chaleur à 10 %. Les cultures ont été incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2/95 % d'air pendant au moins trois semaines avant utilisation pour s'assurer que leur répertoire complet de NMDAR était exprimé. Pour les cultures autaptiques, le jour postnatal 0 (P0), des cellules hippocampiques primaires de rat ont été récoltées et une suspension unicellulaire préparée et étalée sur des micro-îlots d'astrocytes primaires de rat en forme de point. Les micro-îlots ont été préparés en étalant une suspension unicellulaire d'astrocytes sur des micropoints de collagène (62, 5 μg / ml) / poly-d-lysine (50 μg / ml) sur des lamelles en verre recouvertes d'agarose. Pour les cultures corticales, les enregistrements de cellules entières ont généralement été effectués sur les neurones après superfusion avec 1 μM de tétrodotoxine (TTX) pour éliminer l'activité spontanée dans les cultures. Pour les cultures autaptiques, des enregistrements de cellules entières ont été obtenus à partir de neurones uniques se développant sur des micro-îlots d'un ou plusieurs astrocytes. Les enregistrements ont été effectués à température ambiante sur des cultures de 14 à 26 jours in vitro (DIV) avec un amplificateur patch-clamp (Axopatch 200B ou MultiClamp 700A Molecular Devices, Union City, CA). Les neurones en culture ont été surfusés à un débit de 2 ml/min avec une solution externe tamponnée HEPES (en mM) : NaCl, 146 ; KCl, 2,5; CaCl2, 2; HEPES, 10; d-glucose, 20; pH 7,4 (NaOH ajusté), 300–310 mOsm. Des capillaires en verre borosilicaté (GC150F-10, Warner Instruments) ont été utilisés pour tirer des pipettes de patch à l'aide d'un extracteur de micropipette (P87, Sutter Instruments, Novato, CA); les résistances à pointe ouverte étaient de 2 à 7 MΩ avec une solution interne (en mM) : CsCl, 140 ; NaCl, 4; CaCl2, 0,5 ; HEPES, 10; Na-GTP, 0,5 ; Mg-ATP, 2 ; EGTA, 5 ; pH 7,33 (CsOH ajusté); 315 mOsm. Certaines expériences ont utilisé une solution intracellulaire à base de Cs-gluconate (en mM) : Cs-gluconate, 117 ; NaCl, 9; HEPES, 10; et MgCl2, 2; EGTA, 10 ; pH 7,2 (NaOH ajusté). Les courants médiés par le NMDAR ont été enregistrés en l'absence de magnésium extracellulaire et avec 10 à 20 μM de glycine. Les médicaments ont été administrés par un système de perfusion à valve rapide (Lee Company, Essex, CT). Sauf indication contraire, tous les antagonistes ont été achetés auprès de Tocris Bioscience (Ellisville, MO). Les données ont été acquises et analysées sous forme de signaux électriques filtrés et numérisés à l'aide du logiciel PClamp v.10 (Axon Instruments, Union City, CA). Les données ont été affichées et analysées à l'aide du progiciel statistique Origin 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).

Les sous-unités NMDAR mutantes ont été préparées en utilisant le kit de mutagenèse dirigée double brin ChameleonTM (Stratagene) selon les instructions du fabricant. La région codante entière a été séquencée pour vérifier la mutation.

Des rats mâles adultes spontanément hypertendus (SHR) ont été traités avec du PBS ou de la nitromémantine (dose de charge de 65,8 μmol/kg, ip, suivie d'une dose d'entretien de 3,29 μmol/kg toutes les 12 h). Chaque groupe était composé de cinq rats (n = 5). Le traitement pour les deux groupes a commencé 48 h avant le premier jour du test. Le traitement et le test du labyrinthe aquatique ont été effectués en aveugle. Le labyrinthe aquatique consistait en un bassin circulaire de 150 cm de diamètre et de 85 cm de profondeur. La piscine a été remplie pour couvrir une plate-forme mobile, de couleur noire, par 1 cm d'eau. L'eau a été rendue opaque par l'ajout de peinture noire et maintenue à température ambiante (20 à 23 ° C) pendant la durée des cinq jours de test. Une piscine blanche avec de l'eau noire a permis à la caméra vidéo de suivre avec succès les rats blancs avec un contraste maximal. Au jour 1, les rats ont été placés dans la piscine sans plate-forme pendant 60 s d'acclimatation. Les jours 2 à 5 ont été utilisés pour les tests. À partir du jour 2 et jusqu'au jour 5, les rats ont été entraînés pour 24 essais au total (six essais/jour) pour localiser et atteindre la plate-forme submergée. La plate-forme était conservée au même endroit pour tous les essais de chaque session (jour), mais changeait d'une session à l'autre dans un ordre prédéterminé, ce qui donnait quatre emplacements uniques en tout. De plus, il y avait quatre emplacements de rejet possibles (les quatre directions cardinales de la boussole au périmètre de la piscine). Les six essais par session/jour pour chaque animal ont été effectués par paires à partir de différents endroits et tous les animaux ont été testés avant de passer à une autre paire d'essais. De plus, l'ordre des emplacements de chute était constant pour tous les rats, mais, comme la plate-forme, avait un ordre pseudo-aléatoire qui changeait d'une session à l'autre. Chaque session de test de labyrinthe aquatique a été menée de manière continue, sans aucun intervalle de temps majeur entre les essais individuels ou les séries de paires d'essais. Le temps maximum autorisé pour que le rat atteigne avec succès la plate-forme était de 120 s. Si l'animal n'atteint pas la plate-forme dans ce délai, il est guidé manuellement et reçoit un temps de 120 s. Entre les deux essais, le rat est resté sur la plate-forme pendant un minimum de 5 s (cette période de temps exclue pour déterminer la durée de l'essai).

Des rats adultes (275–300 g) ont été sacrifiés par décapitation. Les cerveaux ont été rapidement retirés du crâne et placés dans du liquide céphalo-rachidien artificiel froid (ACSF), en mM : NaCl 116 ; KCl 5,37; NaHP04 1,02 ; NaHC03 26,19 ; CaCl2 3,2; MgSO4 0,8 ; d-glucose 10, pH 7,4, saturé avec barbotage 95 % O2/5 % CO2, à 6 °C. Les hippocampes ont été tranchés à une épaisseur de 40 μm par un hachoir à tissus manuel (Stoelting). Les tranches utilisées provenaient du tiers médian de l'hippocampe, orientées dans un plan perpendiculaire à l'axe septotemporal. Les tranches ont été transférées dans de l'ACSF froid dans une chambre d'interface à écoulement continu et superfusées à 33,5 ° C. L'ACSF et l'interface air étaient saturées avec 95 % d'O2/5 % de gaz barboté de CO2. Après une incubation de 30 minutes, le fluide a été remplacé par de l'ACSF frais avec ou sans MK-801, mémantine ou nitromémantine et incubé pendant 60 minutes supplémentaires avant l'enregistrement électrophysiologique.

Des potentiels post-synaptiques excitateurs de champ extracellulaire (EPSP) ont été enregistrés dans le stratum radiatum de la région CA1 de l'hippocampe après stimulation des collatérales de CA3 Schaffer selon nos protocoles précédemment publiés34. Les enregistrements ont été effectués avec des microélectrodes en verre remplies d'ASCF (résistance 1–2 MΩ); des électrodes bipolaires en tungstène (Fred Haer) ont été utilisées pour la stimulation. Les réponses ont été contrôlées avec un amplificateur CA (systèmes AM). Des électrodes d'enregistrement ont été placées dans le stratum radiatum à une profondeur d'environ 100 μm sous la surface et à 1000 μm de l'électrode de stimulation. Les EPSP de champ ont été évoqués et une courbe d'entrée/sortie a été générée pour déterminer l'intensité du stimulus nécessaire pour induire une réponse semi-maximale. Les stimuli suivants ont été délivrés à cette intensité. Des stimuli d'impulsions appariées ont été délivrés à des intervalles interstimulus de 6 à 200 ms et pour chaque intervalle, le degré d'inhibition ou de facilitation d'impulsions appariées a été calculé. Les valeurs de pente des EPSP ont été utilisées dans le paradigme de test à impulsions appariées. Un seul placement d'électrode a été fait par tranche pour éviter de blesser la tranche. Pendant 10 à 20 min, les réponses de base ont été enregistrées toutes les 30 s. Après une période d'observation d'une ligne de base stable, une stimulation tétanique a été appliquée à la tranche (rafale de 100 Hz pendant 1 s) et appliquée toutes les 30 s pendant 60 à 90 min. La variation en pourcentage de la pente de l'EPSP après le tétanos a été comparée à la ligne de base du prététanos. Une ANOVA à mesures répétées a été utilisée pour comparer les pentes des différents groupes.

L'analyse de la S-nitrosylation des récepteurs NMDA dans le cerveau de rat a été réalisée par le test de commutation de la biotine, comme décrit précédemment48,49. Les thiols libres dans les lysats tissulaires ont été bloqués avec du méthyl-méthanethiosulfonate. Les protéines ont ensuite été précipitées avec de l'acétone et remises en suspension dans du tampon HEN (250 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1 mM néocuproïne) plus 1 % de dodécylsulfate de sodium. L'ascorbate a été utilisé pour réduire sélectivement les nitrosothiols afin de reformer des groupes thiol libres, qui ont ensuite été biotinylés en utilisant 1 mM de biotine-HPDP (Pierce, Rockford, IL). Des réactions parallèles ont été réalisées sans ascorbate comme contrôle pour garantir la spécificité des bandes biotinylées. Les protéines biotinylées ont été capturées sur des billes de streptavidine-agarose et analysées par immunotransfert.

Des rats âgés de sept jours ont reçu une injection ip de véhicule, de MK-801, de mémantine ou de nitromémantine et le cerveau a été examiné 24 h plus tard par TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated dUTP nick-end labeling) pour détecter les cellules apoptotiques. La quantification a été effectuée en utilisant la méthode du dissecteur optique et du fractionneur (Cruz-Orive et Weibel, 1990). En bref, un objectif à grande ouverture et un cadre de comptage (0,05 mm sur 0,05 mm, hauteur de dissecteur 0,07 mm) ont été utilisés pour visualiser et compter les neurones. Des échantillonnages impartiaux ont été effectués en sélectionnant au hasard 8 à 10 champs de visualisation dans le cadre de comptage à différents niveaux focaux en utilisant la méthode du dissecteur optique. La densité de neurones normaux a été déterminée en comptant les neurones dans des coupes de 70 μm d'épaisseur colorées avec une coloration de Nissl (bleu de méthylène, azur II). Le comptage a été effectué en aveugle.

En raison de leur propension connue à l'AVC, similaire à celle des patients humains souffrant d'hypertension, nous avons utilisé des rats hypertendus spontanés (SHR, Harlan) pour induire la tMCAO/R avec la méthode de suture intraluminale34,38,39,40. Des SHR mâles de 200 à 300 g ont été anesthésiés avec 3 % d'isoflurane dans 30 % d'oxygène/70 % de protoxyde d'azote à l'aide d'un vaporisateur d'anesthésique et d'un débitmètre. La température corporelle a été maintenue à 37°C avec un système de température homéothermique. Un moniteur laser Doppler a été utilisé pour surveiller le débit sanguin cérébral relatif (rCBF) pendant l'intervention chirurgicale et la récupération. Les mesures de rCBF ont été effectuées immédiatement après l'anesthésie, après l'occlusion du MCA, juste avant et immédiatement après le retrait de la suture pour initier la reperfusion. Pour initier un accident vasculaire cérébral, une incision médiane a été pratiquée pour exposer la carotide commune droite, la carotide externe et la carotide interne. Les branches de l'artère occipitale de l'artère carotide externe ont été isolées et avec les branches terminales de l'artère linguale et maxillaire coagulées avec une unité d'électrocoagulation. L'artère carotide interne a été isolée et soigneusement séparée du nerf vague adjacent. L'artère ptérygopalatine a été ligaturée près de son origine, deux sutures lâchement attachées placées autour du moignon de l'artère carotide externe et un clip de microanévrisme appliqué sur l'artère carotide externe près de sa bifurcation avec l'artère carotide interne. Une petite ouverture de ponction a été pratiquée dans l'artère carotide externe, un monofilament (suture intraluminale) inséré à travers l'ouverture et les sutures resserrées autour de la lumière contenant le filament. Le clip de microanévrisme a été retiré de l'artère carotide externe et le monofilament a doucement avancé de la lumière de l'artère carotide externe dans l'artère carotide interne sur une distance d'environ 19 à 20 mm au-delà de la bifurcation de l'artère carotide commune jusqu'à ce que le flux sanguin chute (Réduction ≥80 % par la mesure du rCBF). La suture autour du moignon de l'artère carotide externe a été resserrée pour prévenir les saignements. Après 2 h, les sutures ont été retirées, le filament retiré et l'incision suturée retirée, le rCBF récupérant au moins 75 % à la reperfusion. Juste avant la reperfusion, les rats ont reçu de la mémantine, de la nitromémantine ou de la mémantine-OH par injection ip dans un véhicule salin ou un volume équivalent de véhicule seul. Dans les expériences initiales, la dose de charge pour chaque médicament était de 20 mg/kg, correspondant à 90,3 μmol/kg pour la mémantine et à 65,8 μmol/kg pour la NitroMemantine YQW-036 (la dose inférieure d'environ 30 % de NitroMemantine était nécessaire en raison de sa solubilité plus faible en solution aqueuse). Des doses d'entretien (4,63 μmol/kg de mémantine et 3,29 μmol/kg de NitroMemantine, équivalent à 1 mg/kg ou chacune) ont été administrées 12 h après la dose de charge. Comme démontré précédemment, cette dose de mémantine produit une concentration neuroprotectrice biologiquement efficace de 5 à 10 μM à l'embouchure du canal ionique associé au NMDAR35. Dans des expériences ultérieures, la mémantine équimolaire, la NitroMemantine YQW-036 ou la mémantine-OH a été utilisée en utilisant la dose inférieure de NitroMemantine décrite ci-dessus. Les rongeurs ont été sacrifiés 24 h après l'occlusion et la taille de l'infarctus cérébral a été évaluée histologiquement par une coloration au chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium (TTC)50.

Chaque animal adulte a subi une évaluation neurologique51 immédiatement après le retrait du filament et à nouveau 1 jour après la reperfusion (avant le sacrifice). Chaque animal s'est vu attribuer un score comportemental objectif de 0 à 4 : 0 représentant aucun déficit neurologique observable ; 1 défaut d'extension de la patte avant gauche ; 2 tournant vers la gauche ; 3 tombant à gauche; 4 ne peut pas marcher spontanément. Les scores obtenus 24 h après l'AVC ont été moyennés pour chaque point temporel de chaque groupe de traitement et présentés sous forme de score neurologique.

Les valeurs des expériences électrophysiologiques et histologiques sont présentées sous forme de moyenne ± sem. Pour tester les différences statistiques entre les groupes, nous avons utilisé un test t de Student (bilatéral) pour les comparaisons bilatérales et une ANOVA avec test post hoc pour les comparaisons multiples. Pour les tests comportementaux, des tests non paramétriques (test de Mann-Whitney-U) ont évalué la significativité des différences dans les différentes conditions. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Comment citer cet article : Takahashi, H. et al. Antagonisme pharmacologiquement ciblé des récepteurs NMDA par NitroMemantine pour les maladies cérébrovasculaires. Sci. Rep. 5, 14781; doi : 10.1038/srep14781 (2015).

Une correction a été publiée et est annexée aux versions HTML et PDF de ce document. L'erreur a été corrigée dans le journal.

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Nous remercions Mark Washburn pour avoir effectué des expériences préliminaires sur les premiers dérivés de la série de médicaments NitroMemantine, Jonathan Stamler pour sa contribution originale à l'idée de régulation allostérique thérapeutique, la conception de cette classe de composés et son aide à la rédaction du manuscrit, Greg Went pour son aide au développement de médicaments et Traci Fang Newmeyer et Ravi Agarwal pour leur excellent support technique. Ce travail a été soutenu en partie par les subventions du NIH P01 HD29587, R01 EY05477, R21 NS080799 et P30 NS076411, par la subvention du ministère de la Défense (Armée) W81XWH-13-0053 (à SAL), par une bourse postdoctorale de l'American Heart Association 09POST2120061 (à PX ) et par un accord de recherche parrainé par une entreprise d'Adamas Pharmaceuticals, Inc.

Maria Talantova, Emily A. Holland, Nobuki Nakanishi, Scott R. McKercher, Tomohiro Nakamura et Stuart A. Lipton

Adresse actuelle : Neurodegenerative Disease Center, Scintillon Institute, San Diego, CA, 92121

Gary Tong

Adresse actuelle : Lundbeck, Inc., Deerfield, IL, 60015

Takahashi Hiroto, Xia Peng et Cui Jiankun ont également contribué à ce travail.

Centre de recherche sur les neurosciences et le vieillissement, Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, 92307, Californie, États-Unis

Hiroto Takahashi, Peng Xia, Jiankun Cui, Maria Talantova, Karthik Bodhinathan, Wenjun Li, Sofian Saleem, Emily A. Holland, Gary Tong, John Pineapple-Crespo, Dongxian Zhang, Nobuki Nakanishi, Scott R. McKercher, Tomohiro Nakamura et Stuart A Lipton

Panorama Research, Inc., Sunnyvale, 94089, Californie, États-Unis

James W.Larrick

Institut de recherche sur les nouveaux médicaments, Jinan University College of Pharmacy, Guangzhou, 510632, Chine

Yuqiang Wang

Département de neurosciences, École de médecine de l'Université de Californie à San Diego, La Jolla, 92039, Californie, États-Unis

Stuart A. Lipton

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SAL a conçu et supervisé toutes les expériences et préparé le manuscrit. YW et JWL ont réalisé la synthèse chimique des nitrates d'aminoadamantane, l'analyse de la relation structure-activité et l'optimisation du hit-to-lead. HT, PX, MT, TT, JP-C., KB et DZ ont réalisé ou analysé des expériences électrophysiologiques. JC et SS ont effectué la chirurgie pour le modèle animal d'ischémie cérébrale avec l'aide de WLTN ont effectué le test pharmacodynamique montrant la S-nitrosylation du récepteur NMDA avec l'aide d'EHSRM et NN ont aidé à analyser les données, à effectuer une analyse statistique, à préparer des figures et à participer à des expériences. SAL et SRM ont rédigé le manuscrit et tous les coauteurs ont participé à l'édition du manuscrit.

Les auteurs déclarent que SAL est l'inventeur de brevets mondiaux pour l'utilisation de la mémantine et de la nitromémantine pour les troubles neurodégénératifs ; YW et JWL sont également nommés inventeurs sur les brevets de NitroMemantine. Conformément aux directives de l'Université de Harvard, SAL participe à un accord de partage des redevances avec son ancienne institution Boston Children's Hospital/Harvard Medical School, qui a autorisé le médicament mémantine (Namenda®) à Forest Laboratories/Actavis. De plus, SAL et JWL sont les fondateurs scientifiques d'Adamas Pharmaceuticals, Inc., qui a développé des formulations de deuxième génération de mémantine avec Forest/Actavis.

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Réimpressions et autorisations

Takahashi, H., Xia, P., Cui, J. et al. Antagonisme pharmacologiquement ciblé des récepteurs NMDA par NitroMemantine pour les maladies cérébrovasculaires. Sci Rep 5, 14781 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14781

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Reçu : 11 mars 2015

Accepté : 09 septembre 2015

Publié: 19 octobre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep14781

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