La fabrication et l'évaluation de la crème anti-moustique pour la protection extérieure

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 2180 (2022) Citer cet article

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Les infections transmises par les moustiques comme la dengue, le paludisme, le chikungunya, etc. sont une nuisance et peuvent causer un profond inconfort aux personnes. En raison des effets secondaires indésirables et de la toxicité associés aux pyréthrinoïdes synthétiques, un insectifuge à base de N,N-diéthyl-3-méthylbenzamide (DEET), de N,N-diéthyl phénylacétamide (DEPA) et de N,N-diéthylbenzamide (DEBA) produits, nous avons développé une crème anti-moustique à base d'huiles essentielles (HE) (EO-MRC) à base d'huile de girofle, de citronnelle et de citronnelle. Par la suite, une caractérisation de la formulation, une étude de bio-efficacité et d'innocuité de l'EO-MRC ont été réalisées. L'expression des protéines Anti-OBP2A et TRPV1 sur les parties de la tête des moustiques a été étudiée par western blot. Un criblage in silico a également été effectué pour les protéines spécifiques. Une étude FT-IR a confirmé la compatibilité chimique des HE et des excipients utilisés dans l'EO-MRC. Le comportement thermique des meilleures HE et de leur mélange a été caractérisé par analyse thermogravimétrique (ATG). L'examen GC-MS a révélé divers composants chimiques présents dans les HE. L'efficacité de l'EO-MRC était corrélée avec la crème commercialisée à base de N,N-diéthyl benzamide (DEBA) à 12 % (DBMC). Le temps de protection complet (CPT) de l'EO-MRC a été déterminé à 228 min. L'étude de cytotoxicité sur la lignée cellulaire L-132 a confirmé la nature non toxique de l'EO-MRC lors de l'inhalation. Une étude d'irritation cutanée aiguë, une étude de toxicité de dose cutanée aiguë et une étude d'irritation oculaire aiguë ont révélé la nature non toxique de l'EO-MRC. Une étude de toxicité non ciblée sur Danio rerio a confirmé que l'EO-MRC est plus sûr pour les animaux aquatiques non ciblés. Une diminution de la concentration d'acétylcholinestérase (AChE) a été observée chez les rats Wistar exposés à la transfluthrine (TNSF). Alors que l'EO-MRC n'a pas modifié les concentrations d'AChE chez les animaux exposés. Les résultats du Western blot ont confirmé que les protéines anti-OBP2A et TRPV1 étaient inhibées chez les moustiques exposés au TNSF. Les moustiques exposés à l'EO-MRC ont montré un schéma d'expression similaire pour Anti-OBP2A et TRPV1 en tant que groupe témoin. Une étude in silico a révélé que huit composés identifiés des HE jouent un rôle important dans la propriété répulsive globale du produit développé. L'étude met l'accent sur l'activité anti-moustique de l'EO-MRC, qui pourrait être une alternative efficace, écologique et plus sûre aux répulsifs synthétiques existants pour la protection personnelle contre les moustiques dans les conditions de terrain.

Les moustiques sont les principaux vecteurs de plusieurs maladies tropicales, notamment le paludisme, la filariose et les maladies virales telles que la dengue, le chikungunya, le virus du Nil occidental, la fièvre jaune et le zika1,2,3,4. La dengue, propagée par Aedes aegypti (L.) et Aedes albopictus (Skuse), est étroitement associée aux résidences humaines dans les métropoles5,6,7. Les infections transmises par les moustiques ont été documentées comme étant l'une des principales causes de maladie parmi les expatriés de longue date, les voyageurs et les unités militaires déployées à l'étranger, en particulier dans les zones tropicales et subtropicales8. Diverses épidémies majeures et mineures parmi les militaires américains et étrangers ont été enregistrées lors de leur déploiement dans les zones d'endémie palustre de l'Afrique de l'Ouest, de l'Afrique du Nord, du Pacifique Sud et des frontières Chine-Birmanie-Inde pendant la Seconde Guerre mondiale, la guerre de Corée et le Vietnam. Conflit9,10,11.

Malheureusement, il n'existe ni vaccins ni traitements spécifiques pour la plupart des maladies transmises par les moustiques12,13. Par conséquent, il est fortement recommandé à la population des pays d'endémie de la maladie d'éviter les piqûres de moustiques, principalement en portant des vêtements appropriés et en appliquant des répulsifs topiques sur les parties du corps exposées14,15,16. La prévention des piqûres de moustiques dans les espaces intérieurs peut être obtenue en utilisant des moustiquaires insecticides de longue durée (MILD) et des pulvérisations résiduelles intérieures (IRS), une recommandation phare de l'Organisation mondiale de la santé (OMS). Les formulations de vaporisateurs électriques anti-moustiques sont efficaces pour réduire les densités de moustiques dans les zones intérieures. Les répulsifs sous forme de crème, de gel et de lotions sont généralement appliqués sur la peau exposée pour se protéger des piqûres de moustiques dans des conditions extérieures17. Les répulsifs topiques ont tendance à être des composés à faible volatilité18 fournissant une barrière de vapeur sur la peau, ou s'évaporant lentement dans l'air ambiant et éloignant l'arthropode19,20. Les courants de convection causés par les courants d'air et le mouvement des membres de l'hôte peuvent réduire les vapeurs sur la peau exposée18. Les composés répulsifs à point d'ébullition élevé ne conviennent pas à la préparation de formulations topiques en raison de leur vitesse d'évaporation insuffisante, alors que les composants à bas point d'ébullition se dissipent rapidement et facilement21. Le N,N-diéthyl-3-méthylbenzamide (DEET), le N,N-diéthyl phénylacétamide (DEPA), le phtalate de diméthyle (DMP), le N,N-diéthylbenzamide (DEBA) et l'alléthrine sont utilisés dans la plupart des moustiques commerciaux. formulations répulsives11,22, qui sont des produits chimiques synthétiques persistants et non biodégradables23. Leur plus grande exposition à l'environnement peut nuire à l'écosystème23,24,25. Le DEET peut dissoudre le plastique sur les lunettes, les montres-bracelets, etc. dégageant une forte odeur, créant des sensations grasses et de brûlure, et pouvant même provoquer une gêne, en particulier lorsqu'il est appliqué à des doses plus élevées26. De plus, les problèmes émergents liés au développement de la résistance, aux effets secondaires, à la toxicité pour les organismes non ciblés et aux préoccupations écologiques, parmi ces agents répulsifs synthétiques, suscitent de sérieuses inquiétudes27. Les utilisateurs préfèrent donc les répulsifs contenant des actifs alternatifs28.

Les huiles essentielles (HE) végétales ont divers composants chimiques, qui possèdent des propriétés insecticides, répulsives et dissuasives29. Diverses compositions chimiques présentes dans les HE contribuent à l'efficacité des formulations topiques anti-moustiques. Des études suggèrent que les HE pourraient être presque aussi efficaces que le DEET29,30,31. Le Center for Disease Control and Prevention, États-Unis, recommande l'huile de citron et d'eucalyptus comme alternative au DEET en raison de son efficacité contre les insectes32. Des organisations internationales telles que l'Environmental Protection Agency (EPA), les États-Unis (US) et l'Organisation mondiale de la santé (OMS), ainsi que d'autres pays ont approuvé plusieurs HE pour leur utilisation diversifiée en ce qui concerne leur accessibilité, leur disponibilité, leur fiabilité, leur économie et leur faible l'évaluation des risques avec une chimie complexe et ne sont pas soumis aux exigences d'enregistrement fédérales27,33. De nombreux produits naturels à base d'HE sont utilisés comme insectifuges. Cependant, les produits végétaux ont été enregistrés comme insectifuges topiques sûrs et efficaces34, mais leur allergénicité, leur mutagénicité, leur génotoxicité et leur durée de protection complète sont encore discutables. Des recherches approfondies sur une formulation topique efficace, sûre et respectueuse de l'environnement contre les moustiques pour la protection extérieure avec un temps de protection prolongé ont augmenté progressivement35. Par conséquent, dans la présente recherche, nous avons criblé quatorze HE pour leur activité répulsive contre les moustiques Aedes albopictus et développé une formulation de crème anti-moustique plus durable à base d'HE (EO-MRC) utilisant le meilleur mélange d'HE à savoir. l'huile de citronnelle, l'huile de clou de girofle et l'huile de citronnelle. Une étude de caractérisation, d'efficacité, de sécurité et de toxicité de l'EO-MRC a été réalisée avec une étude d'amarrage moléculaire Silico pour résumer l'affinité de liaison des composants EO au site cible. Nous avons également étudié l'expression des anticorps anti-OBP2A et TRPV1 dans la tête d'un moustique par Western blot, ce qui pourrait jouer un rôle important dans la répulsion des moustiques de la peau exposée d'un hôte. En résumé, l'objectif principal de notre étude est de développer et de caractériser une formulation de crème topique à base d'HE pour un anti-moustique à toxicité réduite pour la protection extérieure.

Le pourcentage de répulsion des moustiques de quatorze HE a révélé leur efficacité contre Aedes albopictus (Ae. Albopictus). Cependant, la réponse maximale était évidente avec l'huile de citronnelle (95,83 %), l'huile de clou de girofle (91,66 %), l'huile de lavande (86,95 %) et l'huile de citronnelle (95,83 %), dans le cadre du test biologique du module K&D. L'huile de citronnelle et l'huile de citronnelle ont présenté une répulsion maximale tandis que l'huile de basilic a suscité une répulsion moindre (29,16%). Dans cette étude, quatre meilleures huiles parmi les quatorze huiles essentielles ont été évaluées plus en détail pour leur effet synergique contre les moustiques dans le cadre du module K&D. Le mélange d'huile de clou de girofle, d'huile de citronnelle et d'huile de citronnelle a présenté une propriété de répulsion maximale (96 %), tandis que le mélange d'huile de citronnelle, d'huile de lavande et d'huile de clou de girofle a présenté la moindre réponse (80 %). Le pourcentage de répulsion pour différentes concentrations de quatorze HE et les mélanges des meilleures huiles ainsi que leurs ED50 et ED95 sont présentés dans le tableau 1.

La compatibilité chimique des HE et des excipients à utiliser dans l'EO-MRC a été évaluée par spectroscopie FT-IR. Les spectres FT-IR des analytes sont présentés dans la Fig. S1 supplémentaire, respectivement.

L'huile de citronnelle a montré un pic caractéristique à 791/cm, 1380/cm et 1460/cm pour la flexion C–H qui pourrait être due à la présence de groupe 1,2-disubstitué, alcane et aldéhyde. Un pic à 1260/cm pourrait être dû à la présence d'alkyl aryl éther, un autre pic à 1666/cm et 1714/cm pourrait être dû à la présence d'ester α, β-insaturé, cétone conjuguée. Le pic à 1844/cm et 2908/cm pourrait être dû à la présence d'alcane et un autre pic caractéristique à 3425/cm correspond au groupe alcoolique. Un pic à 990/cm pour une flexion C=C ; 1260/cm pour les étirements C–O ; 1714/cm et 1666/cm pour les étirements C=O ; 2844/cm et 2908/cm d'étirement C–H ; 3425/cm pour les étirements O–H respectivement.

L'huile de clou de girofle a montré un pic à 752/cm pour la flexion C–H ; 1308/cm pour les étirements S=O ; 1714/cm pour les étirements C=O ; 2932/cm pour les étirements C–H ; 3472/cm pour les étirements O–H respectivement.

L'huile de citronnelle a montré un pic à 791/cm pour la flexion C–H ; 1030/cm pour un étirement S=O ; 1284/cm pour les étirements S=O ; 1515/cm d'étirement N–O ; 1610/cm pour les étirements C=C ; 1746/cm pour les étirements C=O ; 2932/cm pour les étirements C–H respectivement.

Le myristate de glycérol a montré un pic à 728/cm et 1465/cm ​​pour la flexion C–H ; 1181/cm pour les étirements C–O ; 1730/cm pour les étirements C=O ; 2844/cm et 2940/cm pour les étirements C–H 3322/cm pour les étirements N–H respectivement.

L'alcool cétylique a montré un pic net à 735/cm et 1465/cm ​​pour la flexion CH ; 1069/cm pour l'étirement C–O, qui pourrait être dû à la présence d'alcool primaire ; 2836/cm et 2908/cm pour l'étirement C–H, pourraient être dus à la présence d'alcane ; 3234/cm pour les étirements O–H ; 3337/cm pour les étirements N–H respectivement.

L'acide stéarique a montré un pic à 754/cm pour la flexion CH ; 1284/cm pour les étirements C–O ; 1730/cm pour les étirements C=O ; 2971/cm pour les étirements C–H 3449/cm pour les étirements O–H respectivement.

La vanilline a montré un pic à 735/cm pour la flexion C–H, ce qui pourrait être dû à certains groupes fonctionnels monosubstitués ; 1260/cm pour l'étirement C–O, pourrait être dû à la présence d'un groupe ester aromatique ; un autre pic à 1515/cm d'étirement N–O ; 1595/cm et 1658/cm pour les étirements C=C ; 3218/cm pour les étirements O–H respectivement.

L'EDTA a montré un pic à 776/cm pour la flexion C–H ; 995/cm pour flexion C=C ; 1269/cm pour les étirements C–O ; 1412/cm pour les étirements S=O ; 1595/cm pour la flexion N–H ; 3218/cm pour les étirements O–H respectivement.

Le paraben de méthyle a présenté un pic à 960/cm pour la flexion C=C ; 1465/cm ​​pour la flexion C–H ; 1730/cm pour les étirements C=O ; 2916/cm et 3281/cm pour les étirements C–H respectivement.

Le benzoate de sodium a montré un pic à 831/cm pour la flexion C–H ; 1061/cm pour l'étirement C–O, qui pourrait être dû à la présence d'alcool primaire ; 1412/cm pour la flexion O–H ; 1547/cm pour les étirements N–O ; 1603/cm pour les étirements C=C ; 3027/cm et 3059/cm pour les étirements C–H ; 3624/cm pour les étirements O–H respectivement.

La paraffine liquide légère a montré un pic à 1388/cm pour la flexion O–H ; 1460/cm pour la flexion C–H ; 2852/cm et 2955/cm d'étirement C–H respectivement.

Le myristate d'isopropyle a montré un pic à 1093/cm pour l'étirement C–O ; 1380/cm pour la flexion O–H ; 1467/cm pour la flexion C–H ; 1738/cm pour les étirements C=O ; 2860/cm et 2923/cm pour les étirements C–H ; 3457/cm pour les étirements O–H respectivement.

La diméthicone a montré un pic à 1061/cm pour l'étirement C–O ; 1260/cm pour les étirements C–O ; 1412/cm pour la flexion O–H ; 1929/cm pour la flexion C–H ; 2916/cm et 2971/cm pour les étirements C–H respectivement.

La vitamine E a montré un pic à 743/cm pour la flexion C–H ; 1770/cm pour les étirements C=O ; 2868/cm pour les étirements C–H ; 3504/cm pour les étirements O–H respectivement.

L'huile de romarin a montré un pic à 982/cm pour la flexion C=C 1465/cm ​​pour la flexion C-H 1750/cm pour l'étirement C=O 2923/cm pour l'étirement C-H respectivement.

Le polyéthylène glycol a montré un pic à 1308/cm pour l'étirement C–O ; 1475/cm pour la flexion C–H ; 1714/cm pour les étirements C=O 2844/cm et 2927/cm pour les étirements C–H respectivement.

Le Tween 20 a montré un pic à 1117/cm pour l'étirement C–O ; 1722/cm pour les étirements C=O ; 2876/cm et 2916/cm pour les étirements C–H respectivement.

Le glycérol a montré un pic à 1110/cm pour l'étirement C–O, ce qui pourrait être dû à la présence d'alcool secondaire, et un pic caractéristique à 1420/cm pour la flexion O–H pourrait correspondre respectivement au groupe alcoolique.

Le propylparaben a montré un pic à 960/cm pour la flexion C=C ; 1269/cm pour les étirements C–O ; 1436/cm pour la flexion O–H ; 1690/cm pour les étirements C=O ; 1937/cm pour la flexion C–H 2964/cm pour l'étirement C–H et pic à 3305/cm pour l'étirement O–H respectivement.

Le mélange physique présentait un pic à 1085/cm pour l'étirement C–O, ce qui pourrait être dû à la présence d'alcool primaire ; 1167/cm pour l'étirement C–O correspond au groupe ester ; 1603/cm pour C=C étirement dû à la présence d'alcène conjugué ; 1722/cm pour les étirements C=O ; 1921/cm pour la flexion C–H pour le composé aromatique ; 2852/cm et 2947 pour les étirements C–H ; 3600/cm pour les étirements O–H pourraient être dus à la présence d'un groupe alcoolique respectivement.

L'étude FT-IR a confirmé la compatibilité des ingrédients de la formulation. Les pics du mélange physique étaient intacts et corrélés aux composants individuels et aucune interaction n'a été observée.

La stabilité thermique de l'huile de citronnelle, de l'huile de clou de girofle, de l'huile de citronnelle et de leur mélange a été étudiée par TGA et les résultats sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire. L'huile de citronnelle a montré une perte de masse de 98,09% en dessous de 300 ℃ qui pourrait être causée par la décomposition du contenu organique de l'échantillon. Le poids de l'huile de clou de girofle est resté constant jusqu'à 60 ℃ et a commencé la décomposition/perte de masse de 60 à 171,7 ℃. Dans la deuxième région de perte de poids, de 171,7 à 599,6 ℃, l'huile de girofle a laissé une masse résiduelle d'environ 0,87 % respectivement. L'huile de citronnelle a montré une décomposition allant de 60 à 228 ℃. Le mélange d'huile de citronnelle, de clou de girofle et de citronnelle a montré la première région de perte de poids de 30 à 260 ℃, respectivement, où tous les composants EO se sont décomposés. Une masse résiduelle d'environ - 16,18 % est restée à 599,6 °C sous la deuxième région de perte de poids (228–600 °C). Le profil TGA pour EO-MRC a montré des variations considérables dans le comportement de perte de poids. Dans une plage de température de 50 à 260 ° C, l'élimination des molécules d'OE chargées avec de l'eau peut se produire à partir des bases de crème répulsive. La deuxième région de perte de poids a été mise en évidence de 270 à 600 ° C, ce qui pourrait être dû à la décomposition des excipients utilisés pour formuler l'EO-MRC.

L'optimisation a été effectuée en définissant les critères des fonctions de désirabilité dans le logiciel Design-Expert. Un tracé de surface de réponse en trois dimensions a été généré par le logiciel (Fig. 1) qui est très utile pour étudier les effets d'interaction des facteurs sur les réponses. Les diagrammes de surface de réponse décrivent l'effet de divers facteurs sur la réponse à un moment donné36. Ici, la figure 1 indique l'effet de différentes concentrations d'HE sur le temps de protection complet (CPT) contre les moustiques. La formule optimisée était basée sur les critères établis de durée de protection maximale. Par conséquent, dix-sept formulations de crème avec les niveaux prédits de facteurs de formulation ont été préparées. Le modèle quadratique non linéaire généré par ordinateur était :

où, 'Y' était le temps de protection complet (CPT), la variable de réponse, associée à chaque combinaison de niveau de facteur ; et l'huile de citronnelle (A), l'huile de citronnelle (B) et l'huile de clou de girofle (C) étaient les niveaux codés (à 2 niveaux ; niveau bas et haut) des variables dépendantes.

Graphique de surface de réponse généré par logiciel montrant l'effet des concentrations d'huile essentielle (X1, X2) sur le temps de protection maximal (Y1). L'optimisation a été effectuée à l'aide du logiciel Design-Expert (Version 6.0.8, Stat-Ease Inc., USA, https://www.statease.com/software/design-expert/). La formulation optimale était basée sur les critères établis de durée de protection maximale. Où, temps de protection complet CPT, huile de clou de girofle CLV, huile de citronnelle LMG, huile de citronnelle CNL.

Les variables, ainsi que leurs niveaux, ont été sélectionnés sur la base des résultats de l'expérimentation préliminaire sont présentés dans le tableau 2. La matrice de conception expérimentale pour les quantités de A, B et C, utilisée pour préparer chacune des dix-sept formulations générées par le logiciel et les réponses ont été observées. L'ANOVA a été réalisée à l'aide du même logiciel pour obtenir la formulation la plus efficace (tableau 3). Neuf solutions de formulation ont été générées, à la suite d'un plan Box-Behnken (BBD) à 17 cycles, à 3 facteurs et à 3 niveaux (tableau 4). La meilleure formulation de crème anti-moustique à base d'HE s'est avérée avoir les compositions suivantes : 8,13 % d'huile de citronnelle, 4 % d'huile de clou de girofle et 4 % d'huile de citronnelle, et des excipients qsp à 100 % (p/p), et la formule optimisée pour 50 g d'EO-MRC sont présentés dans le tableau 5.

EO-MRC a montré des résultats prometteurs contre Ae. albopictus. La valeur CPT pour EO-MRC a été évaluée et comparée avec DBMC. Les valeurs de répulsion ont été évaluées à l'aide du logiciel IBM SPSS Statistics 21. Exécution de la fonction de survie de Kaplan – Meier. Le CPT pour EO-MRC et DBMC a été déterminé à 228 min et 285 min, respectivement. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 et la figure 2.

Graphique de survie cumulée en fonction du temps par rapport à EO-MRC et DBMC pour déterminer le temps de protection complet (CPT). La valeur CPT a été évaluée pour la crème commercialisée à base d'EO-MRC et de DEBA (DBMC). Les données ont été évaluées à l'aide du logiciel IBM SPSS Statistics 21 (version 21.0, 1 New Orchard Road, Armonk, New York 10504-1722, États-Unis, https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software). L'exécution de la fonction de survie de Kaplan – Meier, CPT pour EO-MRC et DBMC a été déterminée.

Sur la base de l'analyse GC-MS des 14 HE, divers composants chimiques ont été identifiés, qui sont connus pour être les principaux constituants chimiques de ces huiles particulières (tableau 7). Nous avons rapporté les résultats GC-MS pour ces quatorze HE dans notre précédent article de recherche37. Compositions chimiques à savoir, carène, caryophyllène, citral, d-limonène, huile de bétulla, camphène, carvéol, cinnamaldéhyde, caryophyllène, citronellal, citronellol, limonène, eugénol, géraniol, isonéral, linalol, longifolène, l-4-terpèneol et α- terpinéol ont été identifiés par GC-MS. Ici, nous avons effectué un amarrage moléculaire pour nous concentrer sur l'affinité de liaison de ces produits chimiques (ligands) aux protéines antennaires du moustique, ce qui pourrait être le premier rapport sur cette zone d'étude.

Des courbes d'étalonnage à quatre points (concentrations) ont été construites pour l'eugénol et le citronellol (Fig. S3 supplémentaire). Le dosage en pourcentage d'eugénol et de citronellol dans l'EO-MRC s'est avéré être de 60,59 % et 55,08 %, respectivement. Le chromatogramme GC – MS de l'EO-MRC est illustré à la Fig. 3. Différents composants chimiques des HE, à savoir le carène, le camphène, l'o-cymène, le d-limonène, l'eucalyptol, le linalol, le citronellal, l'isonéral, l'isobornéol, le l-alpha-terpinéol , citronellol, citral, géraniol, eugénol, caryophyllène, myristate d'isopropyle ont été identifiés dans l'EO-MRC.

Chromatogramme GC-MS de EO-MRC ; où, 1 : 3-carène ; 2 : camphène ; 3 : o-cymène ; 4 : d-limonène ; 5 : eucalyptol ; 6 : linalol ; 7 : citronellal ; 8 : isonéral ; 9 : isobornéol ; 10 : l-alpha-terpinéol ; 11 : citronellol ; 12 : citrique ; 13 : géraniol ; 14 : citrique ; 15 : eugénol ; 16 : caryophyllène ; 17 : myristate d'isopropyle ; 18 : 1-hexadécanol ; 19 : 1-hexadécanol.

L'EO-MRC et la formulation placebo ont été préparés pour obtenir une émulsion huile dans eau uniforme et stable avec un aspect esthétique. L'EO-MRC a montré une bonne uniformité et une bonne capacité d'étalement avec une odeur et une couleur acceptables. Le pH de l'EO-MRC et de la formulation placebo s'est avéré être respectivement de 7,3 ± 0,08 et 6,93 ± 0,13. Les valeurs de densité (1,02 ± 0,01 g/mL) et de viscosité (28 878,33 ± 594,99) indiquaient une stabilité suffisante de l'EO-MRC (les données sont présentées dans le tableau supplémentaire S1). De plus, des études concernant l'effet du stockage à long terme sont nécessaires pour établir la durée de conservation des formulations.

Un schéma décroissant de la mortalité des cellules épithéliales pulmonaires humaines (L-132) a été observé avec des concentrations croissantes d'EO-MRC, alors qu'il y avait une diminution notable de la viabilité cellulaire après exposition aux différentes concentrations d'EO-MRC. La figure 4 représente la viabilité cellulaire estimée, par test MTT, pour le contrôle (non traité) et 62 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL et 1000 µg/mL, de la formulation EO-MRC dans culture L-132. Des concentrations de 500 µg/mL et 1000 µg/mL ont été mises en évidence avec une diminution significative (p < 0,001) de la viabilité cellulaire, cependant, 250 µg/mL ont également inhibé la viabilité cellulaire (p < 0,05) et une concentration EO-MRC de 62 µg/mL et 125 µg/mL n'ont montré aucune différence significative dans la viabilité cellulaire par rapport aux lignées cellulaires L-132 non traitées. ANOVA suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett, où, NS = p > 0,05 ; *p ˂ 0,05; ***p ˂ 0,001 respectivement.

Histogramme comparatif de l'étude de viabilité cellulaire pour l'EO-MRC à différentes concentrations d'essai. Un schéma décroissant de la mortalité de la lignée cellulaire épithéliale pulmonaire humaine (L-132) a été observé avec des concentrations croissantes d'EO-MRC. Une concentration d'EO-MRC de 500 et 1000 µg/mL a été mise en évidence avec une diminution significative (p < 0,001) de la viabilité cellulaire. Le L-132 a également été significativement (p < 0,05) inhibé par 250 µg/mL d'EO-MRC, cependant, les concentrations de 62 et 125 µg/mL n'ont montré aucune différence significative dans la viabilité cellulaire par rapport au L non traité ou témoin. -Lignée cellulaire 132. ANOVA suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett. Où, NS = p > 0,05 ; *p < 0,05 ; ***p < 0,001.

Dans l'étude, aucune réponse cutanée indésirable comme l'érythème ou l'œdème n'a été observée après une période de traitement de 72 h dans les groupes de lapins traités par placebo et EO-MRC. Cependant, les lapins du groupe témoin positif ont développé un érythème sévère ainsi qu'un œdème après 72 h de traitement. La valeur PII des groupes placebo et EO-MRC s'est avérée être de 0, ce qui indique la nature non irritante de l'EO-MRC. Le groupe témoin positif a montré une valeur PII d'environ 5,16, indique une irritation sévère conformément aux directives standard (les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire S2).

Aucun signe clinique lié au traitement n'a été observé pendant la période d'étude. Aucun érythème ou œdème n'était présent, et la zone de peau traitée n'était pas abrasée. Les aberrations dans l'activité locomotrice étaient également absentes. La consommation quotidienne de nourriture et d'eau était normale. Tous les rats avaient un poids corporel normal et semblaient actifs et en bonne santé. Observations histopathologiques de la peau mises en évidence par une architecture normale de l'épiderme (ED), du derme (D), des glandes sébacées (SG) et des follicules pileux (HF) illustrées sur la figure 5a peau témoin ; Fig. 5b Peau traitée par EO-MRC. Le traitement cutané répété d'EO-MRC n'a causé aucun effet indésirable sur le poids corporel et la consommation d'aliments des animaux par rapport au groupe témoin. Tous les animaux se sont avérés en bonne santé tout au long de la période d'étude.

Histopathologie des tissus cutanés dans le cadre d'une étude de toxicité cutanée répétée pour l'EO-MRC sur des rats (a) peau témoin ; (b) Peau traitée EO-MRC. Aucun changement remarquable n'a été observé pour les tissus cutanés exposés à l'EO-MRC dans le cadre d'une étude histopathologique. Histopathologie du tissu branchial de D. rerio (c) branchie témoin ; (d) branchies exposées à l'EO-MRC ; (e) branchies exposées à la deltaméthrine. Les branchies exposées à l'EO-MRC présentent la même architecture tissulaire que le groupe témoin. Le groupe exposé au DLM (témoin négatif) présente une anomalie dans l'architecture tissulaire. Flèche blanche : hyperplasie de base ; EI : infiltration érythrocytaire ; EL : lifting épithélial.

À partir d'une étude d'irritation oculaire aiguë sur des lapins, nos résultats classent l'EO-MRC comme non irritant (Fig. 6). Cependant, la capsaïcine (groupe témoin négatif), en tant qu'irritant connu spécialement utilisé dans l'utilisation de la défense, a été classée dans la catégorie 2B (selon le système UN-GHS), car les réponses d'irritation ont été observées dans les 48 h.

Étude d'irritation oculaire aiguë sur des yeux de lapin après 1 h, 24 h et 48 h d'exposition de groupes témoins (non traités), EO-MRC, capsaïcine (témoin négatif). La capsaïcine a été utilisée ici comme irritant connu, spécialement utilisé dans la capsigranade sous utilisation de défense, appartenant à la catégorie 2B, comme la réversibilité des réponses animales. Le groupe exposé à l'EO-MRC s'est avéré non irritant pour les tissus oculaires.

Les modifications pathologiques les plus fréquentes étaient le soulèvement épithélial, l'infiltration érythrocytaire et l'hyperplasie basique. Sous tous les changements morphologiques observés, la deltaméthrine (DLM) a montré des effets plus graves sur la structure branchiale. Une toxicité minimale pour les tissus branchiaux a été observée dans le groupe exposé à l'EO-MRC et a été mise en évidence par une infiltration d'érythrocytes et une hyperplasie de base. Les résultats sont présentés sur la Fig. 5c gill témoin ; Fig. 5d Branches exposées à l'EO-MRC ; Fig. 5e branchies exposées à la deltaméthrine.

Les enzymes AChE sont situées au niveau de la fente synaptique qui hydrolysent le neurotransmetteur acétylcholine (ACh) en acétate et en choline et mettent fin à la transmission synaptique. Des modifications de l'activité de l'AChE peuvent résulter de l'exposition à certains produits chimiques ou insecticides, qui agissent comme des inhibiteurs de la cholinestérase. D'après les valeurs indiquées sur la figure 7a, il était clair que le niveau d'activité de l'AChE diminuait (83 ± 15 unités) de manière significative (p <0, 01) chez les rats exposés à la transfluthrine (TNSF) par rapport au témoin (177 ± 28 unités) respectivement. Chez les rats exposés à l'EO-MRC, aucune diminution significative (p > 0,05) de l'AChE n'a été enregistrée et la valeur s'est avérée être de 132 ± 13 unités respectivement. ANOVA suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett. Où, NS = p > 0,05 ; **p < 0,01.

Une modification de l'activité de l'AChE peut résulter d'une exposition à certains produits chimiques ou insecticides, qui agissent comme des inhibiteurs de la cholinestérase. La plupart des composants de l'HE ont été signalés comme inhibiteurs de l'AChE. ( a ) Dosage de l'activité AChE sur des rats wistar après exposition au TNSF et à l'EO-MRC; une diminution significative (p < 0,01) de l'AChE a été observée dans le groupe exposé au TNSF. Le groupe exposé à l'EO-MRC n'a montré aucune différence significative (p > 0,05) dans les concentrations d'AChE par rapport au groupe témoin ; ( b ) niveaux d'expression relatifs de TRPV1 et Anti-OBP2A, dans la partie tête du moustique après exposition au TNSF et à l'EO-MRC, tels que quantifiés par ImageJ. Une surexpression significative (p <0,01) de l'anti-OBP2A a été observée dans la partie tête de moustique exposée à l'EO-MRV (13,02 ± 2,05) mais, dans le cas du groupe exposé au TNSF, le niveau d'expression était inhibé (p> 0,05). Les moustiques exposés à l'EO-MRC ont montré des niveaux d'expression similaires à ceux du moustique témoin (p > 0,05). Un modèle d'expression similaire a également été enregistré pour TRPV1 (p > 0,05). L'expression de TRPV1 était plus faible chez les moustiques exposés au TNSF par rapport au témoin (p > 0,05). Mais, dans le cas des moustiques exposés à l'EO-MRV, une expression plus élevée de TRPV1 a été observée, cependant, aucun changement significatif (p > 0,05) n'a été enregistré dans le groupe de moustiques exposés à l'EO-MRC par rapport au groupe témoin. ANOVA suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett. Où, NS = p > 0,05 ; **p < 0,01. Les transferts / gels originaux sont présentés dans les figures supplémentaires. S9–Figs. S11.

Les concentrations de protéines obtenues pour EO-MRV, EO-MRC, TNSF et les moustiques témoins étaient de 7,14 mg/mL, 3,03 mg/mL, 9,146 mg/mL et 3,275 mg/mL, respectivement. Sur la base de ces concentrations, la quantité de chaque échantillon de traitement contenant 50 μg de protéine a été calculée et chargée dans les gels SDS PAGE respectifs. Par conséquent, sur la base des concentrations susmentionnées, 6,68 μL, 16,4 μL, 5,46 μL et 15,26 μL d'EO-MRV, EO-MRC, TNSF et d'échantillons témoins ont été chargés pour SDS PAGE respectivement.

Les niveaux d'expression relatifs de TRPV1 et d'Anti-OBP2A, tels que quantifiés par ImageJ, sont illustrés à la Fig. 7b. En tant que contrôle, le gène domestique, la β-actine, a été expérimenté avant le transfert des autres anticorps et a montré une expression profonde dans la partie de la tête du moustique. L'expression de l'anti-OBP2A a été montrée dans 22 kDa, a montré son expression plus élevée (p <0,01) dans la partie de tête de moustique exposée à l'EO-MRV (13,02 ± 2,05), mais dans le cas du groupe exposé au TNSF, le niveau d'expression a été inhibé (3,37 ± 0,93 ), (p > 0,05). Les moustiques exposés à l'EO-MRC ont montré des niveaux d'expression similaires (6,6 ± 1,5) à ceux du moustique témoin (6,62 ± 1,43), aucune différence significative n'a été observée (p> 0,05). Il n'y a eu aucun changement significatif (p> 0,05) enregistré dans le groupe de moustiques exposés à l'EO-MRC pour TRPV1 (2,9 ± 0,28) par rapport au témoin. TRPV1 dans la partie tête du moustique a montré des bandes à un poids moléculaire attendu de 100 kDa. En termes d'intensité de bande, WB a montré que l'expression de TRPV1 était plus faible, mais elle n'était pas significative (p > 0,05) chez les moustiques exposés au TNSF (2,07 ± 0,58) par rapport aux échantillons témoins (3,23 ± 0,88). Mais, en cas de moustiques exposés à l'EO-MRV, une expression plus élevée (p > 0,05) de TRPV1 a été enregistrée (4,95 ± 1,44). ANOVA suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett. Où, NS = p > 0,05 ; **p < 0,01.

À partir d'études d'amarrage moléculaire, nous avons trouvé huit composés, à savoir l'huile de bétula, le cinnamaldéhyde, le citronellal, le citronellol, l'estragole, l'eugénol, le méthyleugénol et l'o-cymène, qui ont montré une meilleure tendance à se lier au site actif des trois protéines cibles sélectionnées ( données disponibles dans le tableau supplémentaire S3). Mais, en cas d'OBP des deux espèces de moustiques (Aedes et Anopheles), l'huile de betula a montré les meilleurs résultats avec - énergie CDocker - 23,5487 kcal/mol et - 22,737 kcal/mol, respectivement. Alors que, dans le cas de TRPV1 de rats, l'o-cymène a montré les meilleurs résultats avec l'énergie CDocker - 19,981 kcal/mol. Les énergies libres de liaison des meilleurs composés contre leurs cibles respectives sont présentées dans le tableau supplémentaire S4. Les interactions des trois composés contre leurs cibles respectives ont été illustrées à la Fig. 8, où nous avons constaté que l'huile de bétula (salicylate de méthyle) formait deux interactions de liaison hydrogène conventionnelles avec Phe123 et Ile125 ; une interaction de liaison hydrogène carbone avec Leu124 ; six interactions hydrophobes (P-Pi Stacked, Alkyl et Pi-Alkyl) avec Phe15, His111, Trp114, Tyr122 et Ile125. L'huile de Betula a formé une interaction conventionnelle de liaison hydrogène avec Asn84 ; une interaction de liaison hydrogène carbone avec Tyr132 ; sept interactions hydrophobes (Pi-Pi en forme de T, Amide-Pi empilés, Alkyl et Pi-Alkyl) avec Leu72, Tyr73, Val79, Ala121, Ala124, Phe125 et Tyr132 avec l'OBP des espèces Anopheles. O-Cymene a formé deux interactions hydrophobes avec Leu553 et Ile569 ; et une interaction Pi-Anion avec Glu570 de TRPV1 de rats. Tous ces résidus d'acides aminés en interaction sont les composants clés du site de liaison actif rapporté des cibles sélectionnées. Les interactions des composés restants ont été données dans des documents supplémentaires (Figs. S5–Figs. S7 supplémentaires).

Interactions de l'huile de bétula (salicylate de méthyle), du cinnamaldéhyde et de l'eugénol contre. Odorant Binding Proteins (OBP) d'Aedes (a), OBP d'Anopheles (b) et protéines TRPV1 de rats (c). l'huile de betula a formé deux interactions classiques de liaison hydrogène avec Phe123 et Ile125 ; une interaction de liaison hydrogène carbone avec Leu124 ; six interactions hydrophobes (P-Pi Stacked, Alkyl et Pi-Alkyl) avec Phe15, His111, Trp114, Tyr122 et Ile125. O-Cymene a formé deux interactions hydrophobes avec Leu553 et Ile569 ; et une interaction Pi-Anion avec Glu570 de TRPV1 de rats. Tous ces résidus d'acides aminés en interaction sont les composants clés du site de liaison actif rapporté des cibles sélectionnées.

Les répulsifs synthétiques sont toujours problématiques et ont une perception publique négative en raison de leurs effets secondaires et de leur toxicité pour les utilisateurs ainsi que des effets nocifs pour l'écologie et les organismes non ciblés38,39,40. Les HE sont riches en terpénoïdes et efficaces contre les moustiques grâce à leur propriété insecticide et répulsive. Ils sont économiques, sûrs, facilement disponibles, moins toxiques et diminuent les chances de résistance aux insectes en raison de leur chimie complexe. Dans nos recherches précédentes, nous avons rapporté le test d'attraction et de répulsion de quatorze HE contre Musca domestica à l'aide d'un olfactomètre à tube en «Y». Le mélange d'huile de clou de girofle, de citronnelle et de citronnelle a montré une réponse d'orientation de vol maximale. Dans cette étude également, le mélange d'huile de citronnelle, de clou de girofle et de citronnelle a montré les meilleurs résultats contre les moustiques dans le cadre de l'étude K&D. L'efficacité de l'HE dépend des différents phytoconstituants présents dans chaque huile.

Lors de la caractérisation, l'étude FT-IR a confirmé que les HE et les autres ingrédients auxiliaires de la formulation sont compatibles les uns avec les autres et que les pics du mélange physique sont intacts et corrélés aux produits chimiques individuels. Le thermogramme TGA a montré les taux de perte de poids des HE en fonction de l'élévation de la température de 30 à 600 ℃. La perte de poids initiale de l'huile de clou de girofle était de 80 à 90 ℃ 41 auparavant. Dans notre étude, l'EO-MRC a montré la première région de perte de poids de 50 à 260 ° C, ce qui pourrait être dû à l'élimination des molécules d'OE chargées avec des teneurs en eau des bases de crème répulsive. La deuxième région de perte de poids a été mise en évidence de 270 à 600 ° C, ce qui pourrait être dû à la décomposition des excipients utilisés pour formuler l'EO-MRC. Une étude similaire a été réalisée par Sattary et al.; ont préparé des nanoparticules de silice mésoporeuses antifongiques encapsulées dans de l'huile de citronnelle et de l'huile de girofle contre la maladie du piétin du blé42. La GC-MS a été utilisée pour l'identification des compositions chimiques présentes dans l'Eos et également pour évaluer le dosage de l'eugénol et du citronellol présents dans l'EO-MRC. Pour l'identification et la quantification des composés volatils et semi-volatils, la GC-MS a fourni un débit élevé et une sensibilité élevée des résultats analytiques43.

La fonction de survie de Kaplan-Meier était précédemment utilisée par Gray et al. ; pour déterminer la mortalité quotidienne des Ae résistants aux pyréthroïdes. aegypti pour chaque jour d'exposition post-insecticide44. Pour mesurer la fraction de sujets vivants ou survivants ou protégés après le traitement, l'estimation de Kaplan-Meier est l'une des meilleures options à utiliser45. Dans cette étude, un essai biologique sur les moustiques a été effectué pour déterminer le CPT conformément aux directives de test standard, recommandées par l'OMS46. L'efficacité des HE a déjà été rapportée par Azeem et al.47. Ils ont révélé plus de 45 min de temps de protection sous le bras dans le bioessai en cage47. Les résultats de notre étude confirment qu'après avoir transformé le meilleur mélange d'HE en formulations, le produit développé a fourni une protection complète jusqu'à 228 minutes, respectivement.

Les molécules lipophiles présentes dans les HE pourraient pénétrer directement dans les cellules pulmonaires de l'utilisateur car il n'y a qu'une seule membrane cellulaire à traverser. Pour qui, l'effet de respirer les parfums EO de EO-MRC peut être considérable. Des risques de toxicité pour les poumons pourraient exister en raison d'une utilisation excessive d'HE, mais la concentration réelle n'a pas été déterminée et très peu d'études sont disponibles48. L'association des fabricants d'arômes et d'extraits (FEMA) a accordé le statut généralement reconnu comme sûr (GRAS) à la plupart des huiles essentielles et elles sont approuvées par la Food and Drug Administration des États-Unis (US FDA) pour une utilisation dans les produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. Après avoir fait l'évaluation par le groupe d'experts de la FEMA, cela a été revu en 1996. Fondamentalement, la plupart des ingrédients aromatiques à moins de 100 ppm peuvent être utilisés pour l'exposition, et les prévisions concernant leur sécurité peuvent être évaluées49. Ainsi, d'après les résultats de notre étude sur le L-132, l'EO-MRC pourrait être considéré comme approprié pour un anti-moustique efficace sans produire d'effet nocif sur les cellules pulmonaires.

L'étude de détermination de l'irritation cutanée aiguë est utile lorsque la formulation doit être exposée à la peau. Il renseigne sur les risques pour la santé susceptibles de découler d'une exposition de courte durée par voie cutanée50. Une étude d'irritation cutanée aiguë de l'EO-MRC sur le lapin et une étude de toxicité cutanée à doses répétées sur des rats Wistar confirment que l'EO-MRC est sûr et ne produit aucun effet nocif sur la peau. Dans le cadre d'une étude d'irritation oculaire aiguë, l'EO-MRC a prouvé sa nature non irritante pour tous les tissus oculaires. Une substance d'essai est classée dans la catégorie d'irritant oculaire 2A du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques des Nations Unies (SGH des Nations Unies) lorsqu'elle présente une réponse positive de rougeur conjonctivale ≥ 2 ; œdème conjonctival ≥ 2 opacité cornéenne ≥ 1 ; iritis ≥ 1 ; estimé comme les scores moyens après classement dans différents intervalles de temps comme 24 h, 48 h et 72 h après l'instillation de la substance d'essai, et qui s'inverse entièrement dans un temps d'observation de 21 jours. Si les effets susmentionnés sont entièrement réversibles après une période d'observation de 7 jours, la substance d'essai serait alors classée dans la catégorie 2B51.

Les pyréthrinoïdes synthétiques et les organophosphates deviennent une menace pour les poissons et autres animaux aquatiques52. Hedayati et al., ont rapporté des données hématologiques et d'histopathologie branchiale sur le requin irisé (Pangasius hypophthalmus) exposé aux insecticides organophosphorés et pyréthroïdes53. Dans notre étude, la toxicité non ciblée sur D. rerio confirme la nature non toxique de l'EO-MRC. Ici aussi, le DLM a été utilisé comme contrôle négatif. L'histopathologie des branchies de poisson de l'EO-MRC s'est avérée être la même architecture tissulaire que les branchies non traitées (témoins). Notre découverte sur les branchies de D. rerio a des résultats similaires à ceux rapportés précédemment sur l'histopathologie des branchies des poissons.

Une diminution de l'AChE a été déterminée dans le cerveau des rats exposés au TNSF, ce qui pourrait être associé à une augmentation de la peroxydation lipidique54 et à la possibilité d'une perturbation des activités métaboliques et nerveuses55. Cependant, les rats exposés à l'EO-MRC n'ont montré aucune différence significative avec les rats témoins. L'activité accrue de l'AChE entraîne une diminution de la quantité d'ACh, ce qui entraîne une réduction du flux sanguin et une vasodilatation56. Dans l'hypoperfusion cérébrale par ligature des artères carotides communes, la réduction de l'ACh dans la région hippocampique est responsable de troubles de la mémoire et de l'apprentissage57. Dans diverses études de recherche, la perte de terminaisons cholinergiques périvasculaires a été rapportée chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer58,59. De plus, les médicaments inhibiteurs de l'AChE sont connus pour affecter la fonction cholinergique chez les sujets traités avec une hypoxie hypobare (↓activité de l'AChE, ↑niveaux d'ACh et régulation à la hausse de la choline acétyltransférase, enzyme qui joue un rôle dans la formation de l'ACh) et éventuellement la fonction de la mémoire60.

Les protéines de liaison olfactives (OBP) sont le premier relais de la réception semi-chimique chez les insectes car elles font la liaison entre le milieu aérien qui diffuse les signaux chimiques et les récepteurs olfactifs qui sont situés dans les structures olfactives (principalement l'antenne et les pulpes maxillaires) de la périphérie de l'insecte. système sensoriel61. Aucune expression significative de l'OBP-2A dans la tête des rats exposés à l'EO-MRC n'a été observée, cependant, les moustiques exposés à l'EO-MRV, contenant les mêmes HE, ont montré une surexpression de l'OBP-2A. Cela pourrait être dû au schéma d'exposition de l'OT aux groupes cibles. Cela confirme que les HE ont la capacité de surexprimer l'OBP des moustiques. Dans le cas d'une partie de tête de moustique exposée au TNSF synthétique, OBP-2A a été inhibé. En cas de TRPV1, la partie de tête de moustique exposée à l'EO-MRV a montré une surexpression de cette protéine, où le groupe exposé à l'EO-MRC n'a montré aucun changement et le groupe exposé au TNSF a montré une inhibition de TRPV1 respectivement. Cela pourrait indiquer que TRPV1 est davantage exprimé dans les tissus enflammés, associant ainsi son importance dans la cascade inflammatoire antennaire des moustiques. Les mêmes résultats ont été observés en cas d'anticorps anti-OBP2A également. Il s'agit du premier rapport qui démontre l'expression de TRPV1 et d'anticorps anti-OBP2A dans la partie tête du moustique. Les insectes utilisent au moins trois familles de récepteurs olfactifs, à savoir les récepteurs olfactifs (OR), les récepteurs ionotropes (IR) et les récepteurs gustatifs (GR)12,62. Le DEET masque les neurones récepteurs olfactifs (ORN) aux attractifs et diminue la sensibilité à l'acide lactique, un composant de la sueur humaine en diminuant la réponse des neurones excités par l'acide lactique et en augmentant l'inhibition des neurones inhibés par l'acide lactique12.

EO-MRC a montré des résultats très prometteurs contre les moustiques. L'analyse WB a soutenu l'expression significative des protéines cibles lorsqu'elles sont traitées avec une formulation développée contenant les HE en tant qu'ingrédients actifs. Ainsi, dans l'étude in silico, nous avons cherché à connaître les molécules exactes présentes dans les HE responsables de l'activité répulsive. À partir de l'étude d'amarrage in silico, huit composés ont été identifiés qui ont montré une meilleure affinité pour se lier aux protéines cibles des espèces de moustiques et de rats pour former un complexe protéine-ligand stable. L'étude in silico a révélé que les huit composés identifiés des HE jouent un rôle important dans la propriété répulsive globale du produit développé.

HE de basilic (Ocimum basilicum L.), bergamote (Citrus bergamia Risso & Poit), camphre [Cinnamomum camphora (L.) J. Presl.], cannelle (Cinnamomum zeylanicum Blume), citronnelle [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] , clou de girofle (Eugenia caryophyllus Wight), eucalyptus (Eucalyptus globulus Labill.), jasmin (Jasminum officinale L.), lavande (Lavandula angustifolia Mill.), citronnelle [Cymbopogan citratus (DC.) Stapf], mentha (Mentha piperita L. ), le romarin (Rosmarinus officinalis L.), le patchouli (Pogostemon patchouli Benth) et le curcuma sauvage (Curcuma aromatica Salisb.) ont été achetés auprès de Talent Technologies (Talent Technologies, Kanpur, Inde). Le kit de dosage de l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE), l'anticorps anti-OBP2A, les kits ELISA, le 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH), le tampon de radioimmunoprécipitation (RIPA) et le tampon phosphate salin (PBS) ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (Sigma Aldrich Chemical Co., St. Luis, États-Unis). L'anticorps TRPV1 a été acheté à Santa Cruz (Santa Cruz, Californie, États-Unis). Le 1-chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB) a été acheté auprès de Cayman (Cayman Chemical Company, Michigan, USA). La lignée cellulaire pulmonaire normale humaine (L-132) a été obtenue auprès du National Center for Cell Sciences (NCCS), Pune, Inde. L'acétone de qualité pour chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été achetée chez Merck (Merck Pvt. Ltd., Mumbai, Inde). Tous les autres produits chimiques utilisés étaient de la plus haute qualité analytique disponible.

Femelle adulte âgée de 5 à 7 jours Ae. Les moustiques albopictus étaient hébergés à l'insectarium de laboratoire, Division de la technologie pharmaceutique, Laboratoire de recherche sur la défense, Tezpur, Assam, Inde. Les moustiques ont été élevés en maintenant la température à 27 ± 2 °C, l'humidité relative : 75 ± 5 % HR et 14L:10D h de cycles alternatifs lumière-obscurité dans des cages en bois de taille standard (75 cm × 60 cm × 60 cm) avec un ouverture de la manche sur un côté comme décrit précédemment63. Une solution de saccharose à 10% ad libitum a été fournie pour l'alimentation. Avant le test, les moustiques ont été affamés pendant 24 h.

Une étude dose-réponse a été réalisée pour évaluer les meilleures huiles parmi les quatorze HE. Cette étude a été approuvée (numéro d'approbation : 032/2021TMCH, 28/08/2018) par l'Institutional Human Ethical Committee (IHEC), du Tezpur Medical College & Hospital (TMCH), Tezpur, Assam, Inde, et toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Cinq volontaires sont choisis, non allergiques aux piqûres de moustiques et tous les volontaires ont fourni un consentement éclairé écrit. La cuisse d'un volontaire a été marquée selon le trou d'ouverture de la porte du module K&D comme décrit par Klun et Debboun64. Elle est en Plexiglas et la base de la cage rectangulaire (26 cm × 5 cm × 5 cm) comporte six trous, chacun avec des trous rectangulaires de 3 × 4 cm qui s'ouvrent et se ferment par une porte coulissante (Fig. Supplémentaire S8 : Fournir la photographie du module K&D). La région de flexion des avant-bras d'un volontaire humain a été délimitée par quatre zones de test rectangulaires (3 cm × 4 cm). Un volume de 25 µL de chaque concentration des HE dans l'huile de soja (40, 4 et 0,4 µg/cm2) et 25 µL d'huile de soja (diluant) comme témoin a été appliqué sur les zones marquées. Après séchage à l'air pendant 5 min, un module K&D avec des découpes correspondantes dans son sol a été placé sur les zones traitées, contenant cinq moustiques femelles nullipares âgées de 5 à 7 jours dans chaque trou. Les portes des cellules ont été ouvertes et le nombre de moustiques piquant dans chaque cellule a été enregistré dans une exposition de 2 minutes, après quoi les portes ont été fermées. À la fin de chaque observation, les moustiques ont été libérés en ouvrant les cellules du module K&D dans une cage grillagée à manches. Pour chaque test, de nouveaux ensembles de moustiques sont utilisés. Cinq répétitions pour chaque test ont été réalisées. L'efficacité des HE a été déterminée par le pourcentage de répulsion contre les moustiques, en utilisant la formule ou l'Eq. (2) décrit par l'OMS46.

où C est le nombre de moustiques qui atterrissent ou piquent dans la zone de contrôle ; T est le nombre de moustiques atterrissant ou piquant dans la zone traitée.

Des études de compatibilité chimique pour chaque ingrédient de formulation sont nécessaires. Tous les ingrédients de la formulation possèdent une valeur spécifique de fréquence vibratoire et ont des groupes fonctionnels variés dans leurs structures chimiques. Pour l'étude de compatibilité, chaque HE, les excipients à utiliser dans la formulation de la crème et leur mélange physique ont été placés un par un sur la plaque d'échantillon de l'instrument FT-IR (Bruker, ALPHA, Billerica, MA, USA). La sonde de couverture a été placée sur l'échantillon et les spectres IR ont été obtenus sur une longueur d'onde de 2,5 à 25 μm à température ambiante. Les groupes fonctionnels possédés par chaque ingrédient individuel doivent être identiques dans leur mélange physique, ce qui confirme leur compatibilité37.

Le comportement thermique de l'huile de citronnelle, de clou de girofle, de citronnelle, de leur mélange et de l'EO-MRC a été évalué à l'aide d'un analyseur thermique (TG 209 F1 Libra®, NETZSCH-Gerätebau GmbH, 95100 Selb, Allemagne). Environ 10 mg environ de poids d'échantillon ont été placés dans le creuset à chaque fois. L'azote a été utilisé comme gaz de protection. Le programme de chauffage a été fixé à 30–600 °C à une vitesse de 10 °C/min.

Pour l'optimisation, un plan Box-Behnken (BBD) à 17 essais, 3 facteurs et 3 niveaux a été utilisé. Un modèle polynomial de second ordre a été construit par la méthodologie de surface de réponse quadratique (RSM) à l'aide du logiciel Design-Expert (version 6.0.8, Stat-Ease Inc., USA). Au total, dix-sept formulations ont été obtenues en utilisant les concentrations d'OE comme variables dépendantes par rapport au temps de protection complet (CPT) comme variable indépendante ou variable de réponse. L'analyse de variance (ANOVA) a été effectuée en utilisant le même logiciel pour obtenir la formulation la plus efficace.

La méthode de température d'inversion de phase a été appliquée pour la préparation de la crème anti-moustique à base d'OE (EO-MRC). Un échantillon d'environ 50 g de crème a été préparé afin d'en avoir assez pour effectuer les différents dosages qualitatifs et quantitatifs. La phase huileuse (phase B) a été préparée en dissolvant les excipients solubles dans l'huile, à l'exception de la phase A (principes actifs anti-moustiques) sous chauffage doux à 200 tr/min dans un agitateur à plaques magnétiques chaudes (Magnetic Stirrer IKA RCT basic) et chauffé à 65 °C . La phase aqueuse a été préparée en mélangeant divers ingrédients hydrosolubles (phase C) sous chauffage doux et agitation. La température de la phase aqueuse a été portée à 65°C. La phase A a été ajoutée doucement à la phase huileuse à une vitesse d'agitation de 200 tr/min et 55 ± 2 °C. Le mélange a ensuite été émulsifié en ajoutant lentement la phase C et maintenu pendant 1 h à une vitesse d'agitation de 800 tr/min et 60 ± 2 °C. L'EO-MRC formulé a ensuite été conservé pour un refroidissement naturel.

Le CPT de la formulation de crème développée (EO-MRC) a été réalisé par bras dans un essai biologique en cage. 1 ml d'EO-MRC a été appliqué sur ≈ 600 cm2 de la peau de l'avant-bras entre le poignet et le coude et 1 ml de la crème commercialisée à base de 12% de N, N-diéthylbenzamide (DEBA) a été comparé sur l'autre bras . Deux cages à moustiques (taille : 40 × 40 × 40 cm) contenant chacune 200 à 250 femelles Ae non nourries au sang. Albopictus ont été utilisés. Une cage est désignée pour tester l'EO-MRC et l'autre pour le contrôle positif (DBMC). Lors des tests, les mains étaient protégées par des gants chirurgicaux pour lesquels les moustiques ne peuvent pas piquer tandis que le volontaire évite les mouvements du bras. Les bras traités à l'EO-MRC et au DBMC ont été exposés pendant 3 min à des intervalles de 30 min pour déterminer l'activité d'atterrissage et/ou de sondage. Un seul atterrissage ou sondage d'un moustique dans un intervalle de test de 3 minutes conclut le test. Le CPT a été calculé comme le temps (min) requis pour le premier atterrissage ou sondage du moustique après l'application d'un répulsif sur la zone traitée. Le CPT médian et les intervalles de confiance ont été estimés à partir de la fonction de survie de Kaplan-Meier46.

L'efficacité était corrélée avec la crème commercialisée à base de DEBA (DBMC). L'inclusion du produit commercial spécifique DBMC est à titre de comparaison et ne constitue aucune recommandation.

Différents composants chimiques dans quatorze HE et le mélange sélectionné ont été identifiés par un système GC-MS d'Agilent Technologies (5301 Stevens Creek Blvd. Santa Clara, CA 95051, États-Unis). Une concentration d'échantillon de test de 500 μg/mL a été préparée dans de l'acétone de qualité GC. Un volume d'échantillon de 1 µL a été introduit dans l'injecteur maintenu à 250 °C. La température du four de 40 à 300 °C a été programmée à 20 °C/min. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit de 1 mL/min. La température de l'injecteur et du détecteur a été fixée à 250 °C et 230 °C (quadruple) et 150 °C (noyau) respectivement37. Les alcanes saturés standard C7-C30 ont été achetés auprès de Sigma Aldrich Chemicals Co., St. Louis, États-Unis. Les indices de rétention (IR) des composants identifiés ont été déterminés pour l'identification des composants détectés.

Des échantillons d'étalonnage d'eugénol et de citronellol ont été préparés en dissolvant une quantité appropriée dans de l'acétone de qualité GC pour obtenir des concentrations de 62,5 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL et 500 μg/mL. Des échantillons d'essai d'EO-MRC, d'huile de clou de girofle et d'huile de citronnelle ont été préparés en dissolvant une quantité requise dans de l'acétone pour quantifier les composants EO dans la formulation finale. Un volume d'échantillon de 1 μL a été introduit dans l'injecteur comme décrit dans la section « Étude qualitative ».

Les paramètres physiques des formulations EO-MRC et placebo ont été déterminés afin d'établir la conformité esthétique et l'acceptabilité par le consommateur. Pour déterminer la viscosité, un viscosimètre programmable a été utilisé (Modèle : DV2T, Ametek Brookfield, Middleboro, MA, USA) ; combiné avec le logiciel Rheo3000, version 1.2.2019.1 [R]. Le volume de l'échantillon a été fixé à 30 g et les viscosités ont été déterminées à 10 tr/min pendant 40 s à température ambiante à l'aide d'une broche T-Bar (B-92) (jeu de broches Helipath, Brookfield Engineering Labs. Inc). La densité a été déterminée à l'aide d'un pycnomètre. Le pH de l'EO-MRC a été vérifié à l'aide d'un pH-mètre numérique (instruments Labman Scientific, Tamil Nadu, Inde).

La capacité de propagation de l'EO-MRC a été déterminée selon la méthode rapportée précédemment par Sabale65. En bref, 1 g d'EO-MRC a été placé sur une zone circulaire pré-marquée de 1 cm2 sur la lame de verre (7,5 cm × 2,5 cm). L'EO-MRC a été compressé à l'aide d'une autre lame de verre placée du bord au centre de la lame principale. 200 g de poids commercial ont été placés sur le montage et ont laissé le gel s'étaler pendant une période de 1 min. Le diamètre d'étalement a été calculé à l'aide d'un papier millimétré et la capacité d'étalement a été évaluée à l'aide de la formule exprimée en Eq. (3):

où, m est le poids commercial placé sur la configuration ; l est la longueur de la crème à tartiner ; et t est le temps.

La réduction des sels de tétrazolium est maintenant largement acceptée comme un moyen fiable d'examiner la prolifération cellulaire. Le MTT de tétrazolium jaune (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazolyl-2)-2,5-diphényltétrazolium) est réduit par des cellules métaboliquement actives, en partie par l'action d'enzymes déshydrogénases, pour générer des équivalents réducteurs tels que le NADH et le NADPH. À l'aide de moyens spectrophotométriques, le formazan violet intracellulaire résultant peut être quantifié. Le test mesure le taux de prolifération cellulaire et inversement, lorsque des événements métaboliques provoquent l'apoptose ou la nécrose, la réduction de la viabilité cellulaire66.

Les cellules cultivées dans des flacons T-25 ont été trypsinisées et aspirées dans un tube à centrifuger de 5 ml. Le culot cellulaire a été obtenu par centrifugation à 3000 rpm. Le nombre de cellules a été ajusté, en utilisant du milieu DMEM HG, de sorte que 200 μL de suspension contenaient environ 10 000 cellules. Dans chaque puits de la plaque de microtitration à 96 puits, 200 μL de la suspension cellulaire ont été ajoutés et la plaque a été incubée à 37 ℃ et 5 % de CO2 pendant 24 h. Après 24 h, le milieu usé a été aspiré. 200 μL de différentes concentrations de test, à savoir. 62 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL et 1000 µg/mL d'EO-MRC ont été ajoutés aux puits respectifs. La plaque a ensuite été incubée à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h. La plaque a été retirée de l'incubateur et le milieu contenant le médicament a été aspiré. 200 μL de milieu contenant 10 % de réactif MTT ont ensuite été ajoutés à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,5 mg/mL et la plaque a été incubée à 37 ℃ et 5 % de CO2 pendant 3 h. Sans perturber les cristaux formés dans les puits, le milieu de culture a été complètement éliminé. 100 μL de solution de solubilisation (DMSO) ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a ensuite été agitée doucement dans un agitateur à bascule (ROCKYMAX™, Tarsons, Kolkata, Inde) pour solubiliser le formazan formé. L'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 570 nm et également à 630 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Le pourcentage d'inhibition de la croissance a été calculé et la concentration d'EO-MRC nécessaire pour inhiber la croissance cellulaire de 50 % (IC50) a été générée à partir de la courbe dose-réponse pour la lignée cellulaire.

Tous les protocoles d'expérimentation utilisant des animaux ont été réalisés conformément aux "Principles of Laboratory Animal care" (publication NIH 85–23, révisée en 1985) et approuvés par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC) du Defense Research Laboratory (DRL), Tezpur, Assam, Inde (approbation n° CPCSEA/DRL/Protocole n° 3, 20/06/2018). Toutes les études impliquant des animaux sont déclarées conformément aux directives ARRIVE pour la déclaration des expériences impliquant des animaux67. Tous les efforts ont été faits pendant la période d'étude pour minimiser la souffrance des animaux et pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Âgés de 5 à 8 semaines, environ 210 à 250 g de rats Wistar adultes mâles en bonne santé (Rattus norvegicus) et de jeunes lapins albinos néo-zélandais en bonne santé (Oryctolagus cuniculus) ont été obtenus de l'animalerie institutionnelle et autorisés à s'acclimater pendant 7 jours avant l'étude. La nourriture standard et l'eau purifiée ad libitum ont été fournies dans des conditions propres et hygiéniques à 22–25 ℃, 40–70% HR avec des cycles lumière-obscurité de 12 h.

Une étude d'irritation cutanée aiguë a été menée sur des lapins albinos néo-zélandais en bonne santé conformément aux directives de test 40468 de l'OCDE. Environ 24 h avant le test, la fourrure a été retirée de la zone dorsale du tronc. 0,5 g d'EO-MRC, a été appliqué directement sur la peau et après une période d'exposition de 4 h, l'EO-MRC résiduel a été éliminé à l'aide d'eau sans perturber l'intégrité de l'épiderme et examiné pour des signes d'érythème et d'œdème, à 60 min, puis à 24 h, 48 h et 72 h après le retrait de l'EO-MRC. Les réactions cutanées sont classées et enregistrées selon les grades du tableau 8. Selon la méthode décrite par Banerjee et al.69; l'indice d'irritation primaire (PII) a été calculé. De plus, nous avons suivi la méthode de classification de Draize pour le score PII comme non irritant (si PII < 0,5), légèrement irritant (si PII < 2), modérément irritant (si PII ≤ 2–5) et sévèrement irritant (si PII > 5)70, puis le score moyen d'irritation par point dans le temps a été calculé. Les scores moyens au jour 1, au jour 2 et au jour 3 ont ensuite été additionnés et ont suivi l'équation pour obtenir le PII.

où Xa est le score moyen de formation d'érythème ; Xb est le score moyen de formation d'œdèmes ; \(t\_1\) est le jour 1 ; \(t\_2\) est le jour 2 ; \(t\_3\) est le jour 3.

Conformément à la ligne directrice 41071 de l'OCDE, la toxicité cutanée à doses répétées de l'EO-MRC a été effectuée pendant une période de 21 jours. Des rats Wistar en bonne santé ont été logés dans 2 groupes différents (témoins et traités à l'EO-MRC) et chaque groupe contenait 06 animaux après acclimatation initiale pendant au moins 5 jours avant l'étude. En bref, la fourrure dorsale a été retirée à l'aide d'une lame d'épilation de chirurgien stérile (49–20 mm) et une zone dorsale de 4,0 × 4,0 a été traitée avec un placebo et des substances d'essai pendant au moins 6 h/jour sur une base de 5 jours/semaine, pendant 21 jours. . Une observation concernant le poids corporel et la consommation d'aliments a été suivie quotidiennement72.

Pour cette expérience, la procédure de test d'irritation oculaire aiguë OCDE TG 405 a été réalisée sur des lapins jeunes et en bonne santé50. 50 mg d'EO-MRC ont été placés dans le sac conjonctival pendant 5 s en tirant doucement sur la paupière inférieure du globe oculaire droit ; où, l'œil gauche a servi de contrôle. La capsaïcine, un irritant oculaire, a été utilisée comme témoin négatif. L'œil de l'animal n'a pas été lavé pendant les 24 heures suivant l'installation de la capsaïcine. Les observations de toute lésion oculaire à des intervalles spécifiques de 1 h, 24 h et 48 h ont été évaluées à l'aide d'un microscope à lampe à fente (Haagstreit type AIA-11, Appaswamy)73.

Le test de toxicité aiguë sur Danio rerio (D. rerio) a été réalisé conformément aux directives de l'Organisation de coopération et de développement économiques (Test n° 203, Acute Immobilization Test)74. Sept nouveau-nés D. rerio ont été exposés dans chaque récipient d'essai et trois répétitions ont été testées, pour un total de 21 D. rerio par groupe de traitement. Les individus de D. rerio ont été placés dans des récipients contenant 250 mL d'eau pure, et l'EO-MRC a été dilué avec de l'acétone et mélangé dans l'eau à des doses correspondant aux concentrations de 200, 100 et 50 mg/L. L'expérience a été divisée en trois groupes. Les deux premiers groupes étaient constitués d'individus de D. rerio, exposés à l'action de l'EO-MRC et du contrôle négatif de la deltaméthrine (DLM) pendant une durée de 24h75. Les individus de D. rerio du troisième groupe ont servi de contrôle.

Les conditions physiques et chimiques des tests de toxicité aiguë étaient les suivantes : pH variant de 7,2 à 7,6 ; température constante de 25 ± 1 °C ; conductivité électrique autour de 160 μS/cm ; oxygène dissous supérieur à 3 mg/L. Le nombre de D. rerio morts dans les trois répétitions a été compté et utilisé pour déterminer la CL50 pour 24 h d'exposition.

Dans cette étude, la transfluthrine-1,6 % (TNSF) et l'EO-MRC ont été exposés à différents groupes de rats (n = 6) pendant 21 jours. Les animaux témoins n'ont reçu aucune exposition. Au bout de 24 h à partir de la dernière exposition, tous les animaux ont été sacrifiés sans cruauté par dislocation cervicale. Des échantillons de tissus cérébraux ont été prélevés et homogénéisés à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,5, suivi d'une centrifugation à 14 000 tr/min pendant 5 min. Les surnageants clarifiés ont été utilisés pour le dosage, conformément à la procédure décrite dans le bulletin technique du kit de dosage de l'activité de l'acétylcholinestérase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 USA ; numéro de catalogue : MAK119).

Partie de la tête de la femelle Ae. albopictus (n = 100 dans chaque groupe) préalablement exposés à l'EO-MRV (vaporisateur anti-moustique à base d'huiles essentielles), à l'EO-MRC, au TNSF et au contrôle (non traité) ont été isolés et fraîchement homogénéisés dans du tampon RIPA et centrifugés à 12 000 tr/min pendant 15 min. Les surnageants collectés ont été conservés à - 80 ° C pour une utilisation ultérieure. Conformément aux instructions mentionnées dans le protocole de dosage Biorad DC Protein (Bio-Rad, Hercules, CA), les concentrations de protéines dans les échantillons de tissus ont été déterminées. Des réactifs de travail et des dilutions standard de protéines ont été préparés pour construire la courbe standard de protéines. 5 μL d'étalons et d'échantillons de tissus ont été placés dans des puits appropriés, suivis de 25 μL et 200 μL de réactifs de travail A et B respectivement. L'absorbance a été lue à 750 nm après 15 minutes à l'aide d'un lecteur de microplaques (Spinco Biotech Pvt. Ltd., Inde). À partir des résultats de ce test, la quantité de protéines dans chaque échantillon de test équivalente à 50 μg de protéine standard a été calculée pour un chargement supplémentaire dans le processus de transfert.

La quantité requise d'échantillons de test a été mélangée avec une quantité égale de tampon Laemmli et utilisée pour le buvardage. Des gels d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) ont été préparés à partir du gel de résolution d'acrylamide à 10 % (TGX Stain-FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit, Bio-Rad, CA, US) conformément aux instructions du fabricant. Des marqueurs protéiques standard (Precision Plus, Kaleidoscope, Biorad) et des échantillons de tissus préalablement préparés ont été introduits dans différents puits des gels SDS-PAGE coulés. L'électrophorèse a été réalisée dans un système d'alimentation d'électrophorèse Mini-PROTEAN® Tetra System et PowerPacTM HC (Bio-Rad, CA, US). Après électrophorèse, le gel inclus dans la protéine a été transféré à 15 mV (15 min) sur une membrane de nitrocellulose dans la machine Trans Blot Turbo. La membrane incorporée dans les bandes de protéines a ensuite été transférée dans une boîte de Pétri fraîche et incubée sur un agitateur à bascule (Rockymax, Tarsons, Kolkata, Inde) pendant 1 h dans une solution de blocage constituée de solution saline tampon Tris (TBS) avec 0,1 % de Tween 20 et 5 % d'albumine sérique bovine (BSA). Après 1 h, la solution de blocage a été jetée et la membrane lavée trois fois (3 min/lavage) avec une solution TBST. La solution TBST a été complètement pipetée et sans sécher les membranes, des anticorps primaires spécifiquement dilués ont été ajoutés aux membranes. Les membranes ont été sondées séparément avec des anticorps primaires anti-OBP2A et TRPV1 et β-actine (dilués dans 5% de BSA dans une solution saline tamponnée au Tris, pH 7, 4) et incubées pendant une nuit à 4 ° C. Le lendemain, la membrane a été lavée dans du TBST 3 fois (5 min/lavage), suivi d'une incubation de 1 h avec des anticorps secondaires liés à la peroxydase de raifort (HRP) (dilués dans 5 % de BSA dans une solution saline tamponnée au Tris, pH 7,4, (détails mentionné dans le tableau supplémentaire S5) sur un agitateur oscillant à 4 ° C. Après incubation, un substrat ECL fraîchement préparé a été ajouté aux membranes et immédiatement visualisé et interprété dans G: Box Chemi-XRQ gel doc system (Syngene, Royaume-Uni). L'intensité des bandes a été calculée avec les outils génétiques SynGene (SynGene Laboratories, Cambridge, Royaume-Uni). Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Toutes les étapes de quantification des bandes WB ont été effectuées à l'aide d'ImageJ personnalisé (National Institutes of Health ; http://rsb.info. nih.gov/ij/).

Une étude d'amarrage moléculaire a été réalisée pour trouver le ou les composants des HE qui ont tendance à se lier à la ou aux cibles associées à l'activité répulsive. Les composants des HE utilisés dans la formulation ont été identifiés à partir de l'analyse GC-MS. Ensuite, l'identifiant SMILE des composés a été extrait de la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) et chargé dans le logiciel de modélisation moléculaire Discovery Studio 2020 (DS 2020) (Dassault BIOVIA, San Diego, USA )76. Les structures 3D des composés ont été générées et la minimisation de l'énergie des composés a été effectuée selon le protocole standard de DS 2020 en utilisant la méthode du minimiseur intelligent77. Les protéines cibles odorant binding protein (OBP) pour les espèces Aedes (PDB : 3K1E) et pour les espèces Anopheles (PDB : 3QME) et TRPV1 pour le rat (PDB : 5IS0) ont été téléchargées à partir de la banque de données sur les protéines (www.rcsb.org)78 . Les protéines cibles ont été nettoyées, préparées puis réduites en énergie à l'aide de la méthode « minimiseur intelligent » pendant 2 000 étapes avec un gradient d'énergie RMSD de 0,01 kcal/mol77. Après cela, les sites de liaison pour l'étude d'amarrage ont été sélectionnés en utilisant les informations fournies dans la Protein Data Bank pour les sites actifs des cibles sélectionnées. Les sites actifs pour l'OBP des espèces d'Aedes étaient X : 13,63, Y : 40,63, Z : 24,92 et un rayon de 9,8 Å ; pour l'OBP des espèces d'anophèles était X : 20,17, Y : 31,50, Z : 32,09 et un rayon de 7,7 Å ; pour TRPV1 des rats était X : 107,77, Y : 92,80, Z : 103,16 et un rayon de 9,3 Å (Fig. S4 supplémentaire). Ensuite, une étude d'amarrage a été réalisée à l'aide du protocole d'amarrage basé sur la simulation CDocker de DS 2020 qui fournit des informations comparativement plus précises concernant la liaison d'un composé dans le site actif79. Les meilleures poses d'amarrage générées ont également été analysées pour observer les différentes interactions non liées entre les protéines et les composés cibles.

L'énergie libre de liaison à base de MM-PBSA fournit des informations précises sur la stabilité thermodynamique du complexe protéine-ligand dans des conditions physiologiques réelles80,81. Par conséquent, les meilleures poses des composés sélectionnés à partir de l'amarrage ont été analysées plus en détail pour calculer les énergies libres de liaison (ΔG) à l'aide de la méthode MM-PBSA.

La présente étude examine l'activité répulsive d'une formulation EO-MRC non toxique contre les moustiques, conformément aux normes internationales. EO-MRC testé ici, a passé avec succès l'étude d'efficacité contre Ae. albopictus et toxicité préclinique sur différents animaux de laboratoire selon les directives de test de l'OCDE. Le produit développé assure une protection efficace jusqu'à 228 min, contre Ae. albopictus sans produire de risques pour la santé en milieu préclinique. Ainsi, l'étude globale justifie le développement d'une formulation de crème topique à base d'HE, plus durable et non toxique pour minimiser stratégiquement les piqûres de moustiques et réduire les incidents de maladies transmises par les moustiques. Cependant, cette étude n'est pas concluante, une étude plus approfondie sur les tests de répulsion utilisant différentes souches de moustiques, avec différentes procédures d'essai biologique comme l'essai biologique en tunnel, l'olfactomètre à tube en Y, etc., devrait être effectuée. Les tests de toxicité non ciblés, les tests de stabilité ou l'auto-évaluation de la durée de vie de l'EO-MRC sont essentiels pour obtenir des résultats plus concluants. À l'avenir, une émulsion multiple et/ou une formulation de crème liposomale pourraient être conçues pour une libération contrôlée de formulations anti-moustiques dans la peau exposée afin d'atteindre une durée de protection maximale. Cela réduirait la fréquence de dosage dans des conditions extérieures. Une étude sur l'expression d'une protéine plus sensible aux odeurs disponible dans la partie de la tête du moustique pourrait aider la communauté scientifique à comprendre un mécanisme plus détaillé du produit chimique répulsif. Le présent rapport bénéficiera aux étudiants en recherche, aux scientifiques de la formulation et aux sociétés pharmaceutiques pour développer des anti-moustiques à base de plantes efficaces, sûrs et plus durables qui pourraient être applicables aux voyageurs, aux militaires dans les opérations dans la jungle ou au grand public dans les zones d'endémie des moustiques pour se protéger des moustiques.

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Hemanga Hazarika est reconnaissant à l'Organisation de recherche et de développement pour la défense (DRDO), ministère de la Défense, gouvernement. de l'Inde, pour avoir accordé une bourse de recherche (DRL/1206/TC/JRF/04). Les auteurs transmettent leurs remerciements particuliers au Laboratoire de recherche sur la défense (DRL), Tezpur, Assam, Inde, et à l'administration de l'Université de Dibrugarh (DU), Dibrugarh, Assam, Inde, pour avoir fourni tout le soutien nécessaire aux travaux de recherche doctorale. L'auteur remercie également le Dr Rishi Hazarika, MD, directeur principal, Pfizer, Londres, Royaume-Uni, d'avoir révisé ce manuscrit et d'avoir fait des suggestions pour l'améliorer. Sincères remerciements au Dr Sourav Chakraborty, professeur adjoint, Département d'ingénierie et de technologie alimentaires, Université de Tezpur, Assam, Inde pour avoir fourni les rapports TGA à temps ; Sumit Kishor, assistant technique principal, DRL, Tezpur, Assam, Inde pour avoir fourni des données GC-MS ; et Polopalli Subramanyam Raju, JRF, DRL, Tezpur, pour leur aide dans les études AEI. Tous les relecteurs anonymes sont également remerciés pour leurs commentaires spécifiques qui aident beaucoup à améliorer ce manuscrit.

Division de la technologie pharmaceutique, Laboratoire de recherche sur la défense, Tezpur, Assam, 784001, Inde

Hemanga Hazarika, Harshita Krishnatreyya, Danswrang Goyary et Pronobesh Chattopadhyay

Institut Girijananda Chowdhury des sciences pharmaceutiques, Dekargaon, Tezpur, Assam, 784501, Inde

Hemanga Hazarika et Harshita Krishnatreyya

Eurofins Agroscience Services Pvt. Ltd., Tirupur, Tamil Nadu, 641603, Inde

Varun Tyagi

Coromandel Int. Ltd., Shameerpet, Telangana, 500101, Inde

Johirul Islam

Département des sciences pharmaceutiques, Université de Dibrugarh, Dibrugarh, Assam, 786004, Inde

Hemanga Hazarika, Neelutpal Gogoi et Kamaruz Zaman

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HH et HK ont contribué à la conceptualisation, à la méthodologie, à l'analyse, à l'investigation, à la rédaction de l'ébauche originale. VT et JI ont contribué à l'essai biologique sur les moustiques et ont examiné le manuscrit. NG a réalisé un docking moléculaire in silico. DG a supervisé les expériences concernant le western blot. PC et KZ ont conceptualisé et supervisé l'ensemble des expériences.

Correspondance à Hemanga Hazarika ou Pronobesh Chattopadhyay.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Hazarika, H., Krishnatreyya, H., Tyagi, V. et al. La fabrication et l'évaluation de crème anti-moustiques pour la protection extérieure. Sci Rep 12, 2180 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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Reçu : 19 juillet 2021

Accepté : 25 janvier 2022

Publié: 09 février 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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