Vitrification automatisée de cryo - Stockage cryogénique Chengdu Co., Ltd

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 2985 (2022) Citer cet article

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La vitesse et l'efficacité de la collecte de données et du traitement des images en cryo-microscopie électronique ont augmenté au cours de la dernière décennie. Cependant, les techniques de préparation d'échantillons cryogéniques ont pris du retard et des dispositifs de préparation d'échantillons plus rapides et plus reproductibles sont nécessaires. Ici, nous présentons un dispositif de vitrification avec une manipulation d'échantillons hautement automatisée, ne nécessitant qu'une interaction limitée de l'utilisateur. De plus, l'appareil permet l'inspection de couches minces par microscopie optique, puisque l'excès de liquide est éliminé par aspiration par des tubes et non par du papier buvard. En combinaison avec le contrôle du point de rosée, cela permet une préparation de film mince de manière contrôlée et reproductible. L'avantage est que la qualité de l'échantillon cryo préparé est caractérisée avant l'acquisition des données de microscopie électronique. La praticité et les performances de l'appareil sont illustrées par des résultats expérimentaux obtenus par vitrification de suspensions de protéines, de vésicules lipidiques, de cellules bactériennes et humaines, suivies d'une imagerie à l'aide d'une analyse de particules uniques, d'une tomographie cryo-électronique et d'une microscopie lumineuse et électronique corrélée cryo.

La cryofixation dans l'eau vitreuse (glace amorphe) par congélation rapide d'échantillons biologiques peut assurer une conservation structurelle presque parfaite d'échantillons biologiques tels que des suspensions de protéines, des virus, des bactéries et des cellules eucaryotes. La cryofixation nécessite un taux de congélation suffisamment élevé (> 100 000 ° C / s) pour empêcher la formation de glace (cristal). En conséquence, l'eau adopte un état transitoire métastable, amorphe et vitreux1. En utilisant la vitrification, la structure des protéines et des cellules peut être préservée dans leur environnement hydraté natif jusqu'à la résolution atomique. Les échantillons vitrifiés sont compatibles avec les conditions de vide requises pour la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), et peuvent également être étudiés avec la microscopie optique à cryo-fluorescence (cryofLM)2. La microscopie optique et électronique corrélative (CLEM)3 réunit les avantages de la ME (haute résolution, contexte structurel) avec les avantages de la large gamme de techniques de microscopie optique disponibles (imagerie en direct, marquage polyvalent)4,5.

La vitrification par congélation en plongée à l'aide d'éthane liquide, ou d'un mélange éthane/propane comme cryogénique6, s'est avérée être une approche pratique pour la préparation cryogénique d'échantillons biologiques jusqu'à 10 microns d'épaisseur1,7. Pour la cryo-EM, les suspensions de protéines et de virus purifiés sont conservées dans de fines couches d'eau de plusieurs dizaines de nanomètres, à partir desquelles des reconstructions de résolution atomique peuvent être déterminées à l'aide de SPA8,9. Les structures plus grandes, telles que les bactéries et les cellules adhérentes jusqu'à quelques microns d'épaisseur, conviennent également à la vitrification. Les reconstructions tridimensionnelles avec résolution moléculaire peuvent être déterminées à l'aide de la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) d'échantillons jusqu'à environ un demi-micron d'épaisseur10,11. La minimisation de l'épaisseur de la couche liquide est importante car le milieu entourant l'échantillon disperse les électrons, ajoutant au bruit de fond dans les images, abaisse ainsi le rapport signal sur bruit dans les images et réduit la résolution atteignable dans les reconstructions tridimensionnelles résultantes.

L'étape essentielle de génération d'une fine couche d'échantillon liquide sur un support d'échantillon de microscopie électronique pour EM (généralement une couche de carbone trouée supportée par une grille de cuivre de 3,05 mm de diamètre) est problématique, car les couches d'eau minces sont intrinsèquement instables et ont un contrôle exact sur le l'épaisseur de la couche d'eau est difficile. Il a été constaté que rendre le film support hydrophile par décharge luminescente dans l'air ou l'alkylamine12,13 aide à former une fine couche liquide sur le film support et un environnement saturé d'humidité aide à stabiliser la couche mince. La pratique courante actuelle consiste à appliquer plusieurs microlitres de solution d'échantillon sur un film de support à décharge luminescente, puis à éponger l'excès de liquide à l'aide d'un papier filtre qui est ensuite congelé en plongée14,15.

Cependant, cette méthode présente plusieurs défis. Premièrement, il est difficile de contrôler l'épaisseur de la couche d'eau et de déterminer sa répartition sur la grille. Étant donné que l'épaisseur de la couche d'eau est influencée par de nombreux facteurs, notamment les propriétés du support, l'échantillon (type, concentration, tampon, solutés, etc.) et les conditions environnementales (température et humidité)16, les paramètres optimaux sont souvent trouvés au fil du temps. -consommateurs d'essais et d'erreurs impliquant des cycles itératifs de congélation et d'analyse par cryo-EM. Deuxièmement, des quantités relativement importantes d'échantillons sont perdues au cours du processus, car la plupart des échantillons sont absorbés par le papier buvard, ce qui fait que moins d'un pour mille de l'échantillon reste sur la grille17. Troisièmement, il est rapporté que l'utilisation de papier buvard peut entraîner des effets désavantageux, comme l'agrégation et la dénaturation des protéines18,19. De plus, l'application manuelle des échantillons, la manipulation des pincettes et le transfert entre les conteneurs et les différentes machines prennent du temps et nécessitent une formation et des compétences d'utilisation importantes. Étant donné que les applications de pointe actuelles de cryo-EM comprennent le chargement robotique d'échantillons de plusieurs grilles, l'enregistrement de données hautement automatisé20,21 et le traitement d'images à la volée22, la vitesse et la qualité de la préparation des échantillons sont devenues des goulots d'étranglement dans le processus général.

Des méthodes de préparation d'échantillons alternatives au buvardage ont été proposées et développées, qui incluent l'application de quantités minimales d'un échantillon à l'aide de la pulvérisation23,24, de la distribution par jet d'encre25,26, de l'écriture microcapillaire18 ou de l'impression par broche de contact27. Ces méthodes n'ont pas besoin d'éliminer l'excès de liquide de la grille et l'échantillon précieux est utilisé efficacement. De plus, les systèmes de vitrification récemment développés sont hautement automatisés et minimisent les étapes liées aux problèmes de manipulation, de répétabilité et de vitesse. Certains inconvénients de ces systèmes sont que l'étalement de l'échantillon sur la grille est limité dans l'espace ou que des grilles spécialisées sont nécessaires pour un bon étalement28. De plus, la plupart des systèmes conviennent à la vitrification de suspensions mais ne sont pas spécifiquement conçus pour fonctionner avec des échantillons beaucoup plus volumineux, tels que des cellules adhérentes ou des bactéries. De plus, aucune de ces méthodes ne traite de la résolution de cycles de test chronophages entre la vitrification et l'évaluation de la qualité par cryo-EM29.

Ici, nous avons entrepris de développer un dispositif de vitrification pour cryo microscopie qui (i) permet de déterminer l'utilisabilité d'un échantillon vitrifié avant d'effectuer la cryo microscopie, (ii) est compatible avec tous les types d'échantillons (protéines, bactéries et cellules), (iii ) produit des grilles de manière reproductible avec une épaisseur de glace d'échantillon contrôlable, et (iv) a un degré élevé d'automatisation. Nous présentons un dispositif de congélation en plongée qui a une automatisation poussée du processus de préparation des échantillons, y compris la manipulation de la grille, la décharge luminescente, le contrôle des liquides cryogéniques et l'application des échantillons. L'appareil utilise l'élimination de l'échantillon par aspiration - pas de papier filtre - et permet une inspection visuelle de la grille pendant la formation du film mince. L'observation des motifs d'interférence par microscopie optique, associée au contrôle de la température du point de rosée de la grille, permet un contrôle précis de l'épaisseur de la couche d'eau et la détermination du moment optimal pour la vitrification. La surveillance optique de la formation de couches minces avant la plongée s'est avérée être une méthode utilisable et fiable pour l'évaluation de la qualité avant une analyse cryo-EM chronophage. Les résultats que nous rapportons ici montrent que le dispositif peut être utilisé pour la vitrification de protéines, de liposomes, de virus, de bactéries et de cellules pour les techniques de cryomicroscopie à particules uniques, tomographiques et CLEM.

Le piston Linkam est un appareil hautement automatisé qui prépare des échantillons sur une grille de support EM pour la cryomicroscopie électronique à transmission. Les principales caractéristiques sont que l'application de l'échantillon est effectuée par immersion de la grille dans la solution d'échantillon, le réglage de l'épaisseur du film de l'échantillon est effectué en récupérant lentement la grille de la solution d'échantillon, suivie d'une aspiration. La température du point de rosée de l'air de la grille est contrôlée et la formation de l'épaisseur de la couche d'eau sur la grille est inspectée (et enregistrée) en direct par microscopie optique à transmission et/ou à réflexion. Le flux de travail de ce système Linkam diffère des autres flux de travail de plongement de grille depuis les étapes suivantes de récupération de grille à partir d'une boîte de stockage, de décharge luminescente, d'application d'échantillon, d'élimination de liquide, de vitrification (plongement d'échantillon dans une solution cryogénique) et de chargement dans une boîte de stockage cryogénique sont effectués automatiquement (Fig. 1). Dans d'autres dispositifs de congélation en plongée, à savoir le Thermo Fisher Scientific Vitrobot et le Leica EM GP, l'étape la plus importante se situe entre le transfert et la vitrification (qui détermine l'épaisseur de l'échantillon) et est déterminée par un paramètre de temps prédéfini. Dans le piston Linkam, toutes les étapes sont automatisées, à l'exception de la sélection de l'épaisseur de l'échantillon, permettant un minutage précis de la vitrification.

Vue d'ensemble schématique du flux de travail des dispositifs de plongée conventionnels (en haut) où la décharge luminescente et l'application de l'échantillon ne sont pas intégrées au retrait automatisé de l'échantillon et à la plongée ultérieure. Dans l'approche Linkam (en bas), toutes les étapes sont intégrées dans un flux de travail automatisé. Dans cette approche, l'application de l'échantillon n'est pas effectuée par pipetage mais par trempage de la grille dans la solution et le prélèvement de l'échantillon n'est pas effectué par buvardage avec du papier filtre mais par aspiration avec un tube. Le processus de formation de la couche mince est suivi en direct et seul le moment de la plongée est effectué manuellement, exactement à l'opposé du flux de travail traditionnel.

La conception de la section cryo du piston Linkam (Fig. 2) est liée à celle de l'étage cryo Linkam CMS 19630. Le piston contient un (1) récipient de stockage d'azote liquide (Fig. 2 a gauche) ; (2) une région centrale (couverte) contenant le conteneur cryogénique, la chambre environnementale et l'unité de décharge luminescente (Fig. 2b, c); (3) un appareil photo numérique et un objectif de microscopie optique ×10 (resp. derrière et devant les conteneurs) ; (4) des brucelles à commande mécanique et mobiles (sur les chambres), qui sont toutes montées sur (5) un châssis en aluminium contenant les groupes électriques et les pompes. Le piston Linkam et la caméra sont connectés à un ordinateur portable avec un logiciel de contrôle (pas sur la figure).

une disposition de piston Linkam avec réservoir d'azote liquide (à gauche), contrôle des pincettes (en haut) autour des chambres centrales (boîte blanche). b Chambres centrales avec une chambre cryogénique (à gauche), une chambre environnementale (au milieu) et un déchargeur luminescent (à droite) et une lentille (en bas). c La chambre cryogénique est remplie d'azote liquide à partir du conteneur d'azote liquide (voir a) et contient une boîte de stockage de grille cryogénique et un conteneur d'éthane liquide (toujours du film supplémentaire 1, pour plus de clarté, le tube de gaz éthane et le couvercle en laiton ne sont pas montrés) , la chambre climatique centrale contient deux positions pour les conteneurs d'échantillons et une place pour trois grilles. Au centre se trouve un "verrou de pince" à température contrôlée qui refroidit la pince tout en mettant la grille en position pour l'élimination de l'eau par les tuyaux d'aspiration (non illustrés) et l'inspection visuelle simultanée par la lentille. d Boîte de grille pour trois grilles. e Bloc thermorégulé avec conteneurs d'échantillons et verrouillage pour pincettes et fente pour le positionnement de la grille pour les tubes d'aspiration et la microscopie optique.

L'azote liquide Dewar (Fig. 2a) contient jusqu'à 200 ml d'azote liquide qui peut être rempli à travers un entonnoir et protégé par un couvercle avec un tube isolant ouvert pour la sortie d'azote gazeux (non présent sur la Fig. 2). L'azote liquide à l'intérieur du Dewar est surveillé par un capteur de température et le niveau dans la chambre cryogénique est maintenu constant grâce à une vanne contrôlant l'appoint.

La chambre cryogénique (Fig. 2b, c) contient un emplacement pour installer une boîte de stockage de grille cryogénique sur mesure, qui peut contenir trois grilles vitrifiées pour le transport et le stockage et le conteneur d'éthane liquide. Le bain d'éthane et les tubes de remplissage de gaz associés (non représentés) sont à température contrôlée pour permettre une condensation automatisée du gaz éthane. Un niveau et une température constants (à -183 ° C) sont maintenus pour le bain de cryogène liquide afin d'éviter le gel de l'éthane. Étant donné que la chambre cryogénique est relativement petite, le haut de la chambre cryogénique est protégé par une plaque de cuivre refroidie (Fig. 2b) pour maintenir la température cryogénique de la phase gazeuse.

La chambre climatique (Fig. 2b, c) est contrôlée en température par un élément Peltier et peut être réglée entre 3 et 50 °C. Le fond de la chambre peut contenir quelques mL d'eau déminéralisée pour générer de l'humidité par évaporation. La zone de grille contient une boîte de grille amovible (Fig. 2c, d) qui peut stocker jusqu'à trois grilles EM qui peuvent être récupérées et utilisées pour la décharge luminescente et l'application ultérieure de l'échantillon. Alternativement, il contient une boîte avec des cellules cultivées en adhérence sur des grilles EM dans un liquide. La chambre climatique contient également deux positions pour les conteneurs d'application d'échantillons liquides. Une configuration de microscope intégré à objectif ×10 avec des modes de lumière transmise et réfléchie par LED peut imager la grille EM à l'intérieur de la chambre d'humidité tandis que la pince à épiler tenant la grille est insérée dans le "verrou de pince à épiler" devant l'objectif. Ce "verrou à pince" en laiton à température contrôlée (Fig. 2e) contient une fente à travers laquelle la pince à épiler avec la grille peut être positionnée dans un cylindre creux. Ici, la grille est positionnée pour le retrait simultané de l'échantillon par aspiration et imagerie par microscopie optique. Un module d'aspiration interchangeable avec jusqu'à trois tubes d'aspiration est positionné contre le bord extérieur de la grille pour l'élimination de l'excès de liquide. La température du "verrou de la pince à épiler" est réglée à une température inférieure à celle de la chambre de sorte que la pointe de la pince à épiler et la grille peuvent être réglées autour du point de rosée pour contrôler l'évaporation de l'eau et ainsi l'épaisseur de la couche d'eau et empêcher simultanément un changement dans la concentration de l'échantillon .

L'unité de décharge luminescente a trois positions pour les grilles situées entre deux électrodes. Le volume est automatiquement pompé à 1,8 × 10−1 mbar en une minute à l'aide d'une petite pompe à vide sans huile. La décharge luminescente est automatiquement effectuée selon des paramètres programmables, généralement en 2 min à 5 mA dans l'air.

La préparation du plongeur Linkam pour l'utilisation se fait en mettant sous tension toutes les unités électriques (refroidisseur d'eau Peltier, réchauffeur de lentille, plongeur et PC de support), en connectant ou en remplissant tous les consommables (bouteille de gaz éthane, azote liquide dans le Dewar, eau dans l'environnement chambre, boîte de stockage de grille dans le conteneur cryogénique, grilles EM dans la cartouche de ramassage de grille, échantillon liquide dans le conteneur d'échantillon) et démarrage du logiciel de contrôle du piston et de la caméra et démarrage du protocole de remplissage d'éthane liquide. Un protocole détaillé est présenté dans la note complémentaire 1.

La préparation de la Cryo-grille est effectuée automatiquement après le démarrage de la séquence programmée (Supplémentaire Film 1). Tout d'abord, une grille est saisie par les pincettes et transférée dans l'unité de décharge luminescente où elle est libérée et rendue hydrophile dans le plasma d'air. Ensuite, la grille à décharge luminescente est à nouveau récupérée et transférée dans le récipient rempli d'échantillon où l'échantillon est appliqué sur la grille en plongeant dans le liquide d'échantillon à température contrôlée. Un minimum de 10 µL est nécessaire pour remplir le récipient d'échantillon. Par trempage, <0,5 µL est effectivement appliqué sur la grille, qui est <2–3 µL qui est généralement utilisée par application manuelle. Le temps de trempage de la grille, ainsi que la vitesse de rétraction de la grille du réservoir de liquide, sont tous deux programmables. La grille est ensuite placée devant une lentille de microscopie optique x10 à température contrôlée par la pince à épiler. La pointe de la pince à épiler et la grille qu'elle contient sont toutes deux à température contrôlée dans cette configuration car la pince à épiler touche le "verrou de pince à épiler" en laiton à température contrôlée, réglé à quelques degrés sous le point de rosée de la température de la chambre climatique. Ensuite, un module d'aspiration contenant deux ou trois tubes est placé devant la grille, en contact avec le bord de la grille, et lors de l'activation, l'excès de liquide est aspiré avec un débit réglable et calibré. Simultanément, l'épaisseur de la couche d'eau sur la grille est surveillée visuellement par le microscope avec la caméra attachée et le moment du transfert vers le conteneur d'éthane liquide et la vitrification par plongée est déclenché par l'opérateur sur la base de l'image de la caméra en temps réel. Après vitrification, la grille est transférée dans la boîte de stockage de grille cryogénique ou une cryo-cassette pour l'imagerie par cryo-fluorescence dans la cryo-étage CMS196V3.

Pour fournir une vue sur la grille pour l'observation en microscopie optique en temps réel, des tubes ont été utilisés pour éliminer l'excès de liquide de la grille EM au lieu du papier filtre (Figs. 3 et 4, Film supplémentaire 3). L'observation au microscope optique du «liquide en vrac» sur la grille après application de l'échantillon par trempage n'entraîne aucune caractéristique spécifique conduisant à une estimation de l'épaisseur de la couche d'eau (Fig. 3a). Lorsque l'eau s'amincit, des motifs d'interférence colorés en couches minces commencent à apparaître, générés par l'interférence de la lumière émanant de l'interface air-eau du côté carbone de la grille et du film de carbone (Fig. 3b). Lors de l'élimination supplémentaire du fluide, ces franges d'interférence colorées disparaissent, lorsque la distance entre la surface de l'eau et la couche de carbone devient inférieure à ~ 200 nm (Fig. 3c). Après une élimination supplémentaire du liquide, un motif lumineux en forme de croix apparaît lorsque le réservoir du ménisque sur le côté de la grille est formé (Fig. 3d). À ce moment, un disque brillant apparaît au centre du carré (Fig. 3e) car l'épaisseur de la couche d'eau au centre est réduite à environ moins d'un micron (comme observé à partir de la transparence électronique résultante après vitrification). Sur les côtés, un ménisque d'eau plus épais est toujours attaché aux barres de la grille, apparaissant dans un bord sombre (Fig. 3f). Lors d'une élimination supplémentaire de l'eau, cette eau peut également être complètement éliminée (non illustrée ici), mais d'après notre expérience, le centre de la grille est également asséché. Les observations Cryo-EM ont montré que seuls les deux derniers "états" ont, après vitrification, une couche d'eau vitrifiée transparente aux électrons (Fig. 3e et f), tandis que les autres états dépassent la profondeur de pénétration des électrons, ce qui entraîne des carrés noirs dans le cryo -Images EM. Ainsi, le moment optimal pour la vitrification est lorsque les carrés de la grille, lorsqu'ils sont observés au microscope optique, semblent avoir une région centrale brillante et un anneau extérieur sombre. Pour obtenir un large champ de vision dans nos expériences, nous avons principalement utilisé un objectif ×10. Cependant, l'utilisation d'un objectif ×20 a permis d'observer plus clairement les différences entre les trous ouverts et recouverts d'eau (en utilisant la feuille de carbone Quantifoil 2/2), ce qui a permis une détermination plus précise du point de vitrification, au détriment des connaissances sur l'épaisseur. variation de la couche d'eau sur la grille (Fig. 3C supplémentaire).

Évaluation de l'épaisseur du film par LM en temps réel et cryo-EM. Deux premières colonnes : observations LM (vue d'ensemble de la grille, carré de la grille), troisième colonne : vue cryo-EM du même carré après vitrification, dernière colonne : vue schématique de côté figure explicative d'un carré avec des barres de grille en brun clair, couche de carbone en gris et les surfaces liquides en lignes bleues. a Juste après l'application de l'échantillon par trempage, la solution d'échantillon en vrac est présente des deux côtés de la grille et aucune particularité n'est observable en microscopie optique. L'aperçu schématique montre la surface du liquide (lignes bleues), les barres de la grille (beige) et la couche de carbone d'un côté de la grille (gris). b Après l'élimination de l'eau, des anneaux d'interférence colorés apparaissent, vraisemblablement dus à une légère interférence entre la surface de l'eau et la couche de carbone du côté carbone de la grille. Les lignes d'interférence peuvent apparaître dans un carré, mais peuvent également s'étendre sur plusieurs carrés. c Les motifs d'interférence disparaissent et près des bords de la grille, l'apparence change légèrement en raison du contact de la couche d'eau avec les barres de la grille. d Au centre des carrés de la grille apparaît une tache plus claire, vraisemblablement parce que la surface de l'eau adopte une forme concave à l'intérieur du carré. e Encore une fois, des anneaux d'interférence apparaissent, maintenant en raison d'interférences entre l'autre couche d'eau et la couche de carbone (voir Film supplémentaire 3). Le point le plus clair représente des couches d'eau plus fines que quelques centaines de nanomètres : images cryo-EM ce carré montre des régions centrales transparentes aux électrons. Les régions plus sombres sur les bords de l'image LM sont probablement le résultat de rayons lumineux réfractés vers et absorbés par les barres de la grille. f La région centrale se dilate dans l'image LM. Cryo-EM montre une expansion de la région transparente aux électrons tandis qu'un bord mou apparaît sur les bords. Des vues comme en e et f sont le bon moment pour la vitrification et se traduisent par des carrés de grille utilisables pour l'imagerie cryo-EM. Un bon et simple critère visuel est que le cadre noir autour du carré de la grille recule à nouveau après avoir dépassé la plus grande zone comme indiqué en (e).

a Aperçu LM de la grille EM avec échantillon liquide (en haut, dernière image du film avant la vitrification) et b aperçu cryo-EM de la grille après vitrification (en haut). Les numéros 1, 2 et 3 en a et b désignent les mêmes carrés de grille montrant l'apparition en LM et EM d'épaisseurs d'échantillons différentes. L'épaisseur optimale de l'échantillon est atteinte autour de la position 2. Notez qu'en b, encart 3, la plupart des trous sur le film de support ne sont pas recouverts d'une couche de glace, et b, encart 2, contient plus de trous utilisables dans le film de support pour l'acquisition de données. Les cercles blancs indiquent les positions des tubes d'aspiration.

Les premières expériences ont montré que l'aspiration du fluide à l'aide d'un seul tube d'aspiration positionné sur le côté inférieur de la grille entraînait un gradient d'épaisseur abrupt entre les carrés remplis d'eau et les carrés secs. Par conséquent, à tout moment du processus, seul un nombre très limité de carrés présentait l'épaisseur souhaitée qui convenait à la collecte de données. Pour obtenir plus de carrés avec une épaisseur optimale, et une meilleure répartition sur la grille, nous avons testé plusieurs dispositions de tubes d'aspiration. Il est apparu que le positionnement de deux tubes d'aspiration sur les côtés gauche et droit de la grille donnait les résultats les plus reproductibles et les meilleurs (Fig. 2 supplémentaire). L'apparence, la qualité et la facilité d'utilisation globale pour la collecte de données des grilles produites (Fig. 4) étaient comparables à celles vitrifiées dans notre laboratoire à l'aide du Thermo Fisher Scientific Vitrobot ou Leica EM GP.

Étant donné que l'élimination de l'eau s'effectue sur les côtés de la grille alors qu'à la position (centrale) de la pointe de la pince à épiler, l'eau est souvent retenue sur la grille, un gradient d'épaisseur est créé, ce qui permet un minutage approprié de la vitrification pour produire une grande surface de grille utilisable carrés. Il faut dire que l'échantillon lui-même (composition, viscosité, tension superficielle) influence le comportement de ce gradient et la quantité d'eau retenue sur la grille. Aussi, le type de grilles (mailles, vendeur, épaisseur) et la qualité (rides, déchirures, trous) de la couche de carbone ainsi que le type de film de carbone (dentelle ou quantifoil : quantité et taille des trous), influencent le comportement de l'eau sur le grille lors de l'amincissement de la couche par aspiration. Les différences individuelles entre les grilles et les échantillons n'ont cependant pas influencé la qualité des grilles vitrifiées. Pendant la préparation, chaque échantillon est évalué individuellement.

De plus, l'observation LM a permis l'observation de plusieurs phénomènes qui se sont avérés utiles pour évaluer la qualité du maillage. Tout d'abord, l'agrégation des protéines et des vésicules sur la grille a pu être observée lors de l'élimination de l'eau par aspiration. Les agrégats de l'ordre du micron conduisent à des variations locales d'épaisseur de la surface de l'eau qui se traduisent par des variations de contraste observables par LM. L'agrégation de protéines dans les trous de la feuille n'a pas pu être observée dans la configuration actuelle. De plus, des taches hydrophobes sur la feuille de carbone ont parfois été observées par une rétraction non uniforme des bords de l'eau (Fig. 3 supplémentaire).

Bien que l'inspection visuelle des carrés de la grille dans l'image optique avant de plonger soit une indication utile de la qualité et de la facilité d'utilisation de la grille vitrifiée résultante par cryo-EM, l'épaisseur du film de glace sur les trous de la couche de carbone est d'une importance capitale. Les trous individuels de deux micromètres de diamètre dans les grilles Quantifoil R2/2 EM peuvent être observés avec un objectif ×10 NA 0,25 en combinaison avec un appareil photo numérique de 5 MP, ce qui permet de déterminer si les trous restent recouverts d'eau ou s'ouvrent par la grande surface tension. La tendance générale était que dans les carrés avec de l'eau à ses bords, les trous dans le film de carbone sont recouverts. Lorsqu'il y a peu d'eau sur les bords extérieurs du carré, les trous sont ouverts et non recouverts d'eau.

Alors que la présence d'eau en vrac est contrôlée par aspiration, les couches d'eau minces intrinsèquement instables sont sensibles à l'humidité relative de leur environnement. Étant donné que l'instrument n'a pas de contrôle actif de l'humidité (pour augmenter l'humidité ambiante afin de réduire l'évaporation), la grille est entourée d'une humidité variable d'environ 79 % (typique aux Pays-Bas). Par conséquent, la pointe de la pince à épiler et donc la grille ont été refroidies à quelques degrés sous la température définie dans la chambre climatique à l'aide d'un "verrou de pince à épiler" (Fig. 2c) pour maintenir la grille au point de rosée et éviter l'évaporation18. De cette façon, nous avons pu contrôler l'évaporation de l'eau de la grille et maintenir des états favorables à la vitrification (Fig. 3e et f) pendant plusieurs minutes (Fig. 4 supplémentaire et Film supplémentaire 2).

Pour valider les performances du dispositif de vitrification, nous avons testé une variété d'échantillons et de techniques. Hormis l'adaptation des concentrations des solutions, nous n'avons optimisé aucun paramètre et tous les échantillons ont été réalisés en quelques séances de vitrification. Pour l'analyse de particules uniques cryo-EM, nous avons vitrifié l'apoferritine fraîchement purifiée et préparé quelques grilles. À partir de l'une des grilles, nous avons enregistré plusieurs milliers d'images et déterminé une reconstruction de 2, 4 Å dans laquelle nous avons pu insérer la structure des rayons X (entrée PDB 6RJH) (Fig. 5a).

a Résultats d'analyse de particules uniques pour l'apoferritine (n = 1). Image cryo-EM typique de la collecte de données (à gauche), reconstruction 3D de l'apoferritine à une résolution de 2,4 Å (au milieu) et ajustement de la structure aux rayons X de l'apoferritine de rate de cheval (PDB 6rjh en jaune) dans la densité EM (à droite). b Cryo-ET sur des cubes d'origami d'ADN (n = 1). Vue Cryo-EM de plusieurs trous dans une feuille de carbone trouée (à gauche) et de la distribution des particules dans un trou (au centre à gauche), une coupe à travers le volume du tomogramme montrant le haut des rubans d'ADN (au centre à droite) et une surface 3D rendu de 12 cubes origami ADN (à droite, colorés individuellement). c Cryo-EM de vésicules lipidiques (n = 5). Aperçu Cryo-EM montrant l'épaisseur de la glace dans un carré de maille de grille EM qui est généralement utilisé pour la collecte de données (à gauche) et un aperçu de la distribution des vésicules dans un trou dans le film de carbone (au centre à gauche), une tranche à travers un volume de tomogramme de une vésicule multicouche (au centre à droite) et le rendu de surface 3D des couches lipidiques individuelles (à droite, avec des couches lipidiques colorées).

Pour Cryo-ET, nous avons vitrifié des cubes d'origami d'ADN. Il s'agit d'un échantillon qui a tendance à s'agréger et à coller à l'interface air-eau. Bien que l'agrégation n'ait pas été significativement réduite, nous avons pu effectuer la cryo-ET. La reconstruction tomographique a clairement montré l'ADN comme les rubans du cube (Fig. 5b). Dans une autre expérience, visant l'imagerie cryo-EM 2D de vésicules liposomales, des vésicules d'amphotéricine B (Ambisome®) ont été vitrifiées. Les images Cryo-EM de ces échantillons ont montré de bonnes distributions de trous couverts dans un carré de grille et de bonnes images de nombreux trous ont été obtenues (Fig. 5c deux panneaux de gauche). Des échantillons ont également été préparés cryo-ET sur des vésicules multilamellaires, révélant plusieurs couches membranaires des vésicules (Fig. 5c deux panneaux de droite).

En plus d'être adapté aux suspensions protéiques et liposomales, le dispositif de vitrification permet également la préparation de cellules. Ceci est démontré par la vitrification et l'imagerie cryo-ET des suspensions de bactéries E. coli et de 17 cellules de souris clone 1 qui ont été cultivées de manière adhérente sur des grilles EM en or (Fig. 6a, b). Enfin, nous avons également effectué une cryo-CLEM sur ces cellules eucaryotes, colorées par fluorescence avec Mitotracker, par imagerie cryo-LM ultérieure (Fig. 6c, à gauche) et cryo-EM supplémentaire (Fig. 6c, milieu, droite).

a Cryo-microscopie électronique de bactéries. Vue d'ensemble cryo-EM typique d'un carré à maille unique d'un échantillon bactérien montrant l'épaisseur de la glace et la distribution des bactéries (à gauche) et une vue dans un trou du film de carbone (à droite). b Vue d'ensemble cryo-EM typique d'un carré à maille unique de cellules cultivées sur une grille EM (à gauche) et image cryo-EM dans une partie mince de la cellule montrant des vésicules internes et des mitochondries avec des inclusions denses aux électrons riches en phosphate typiques (à droite) . c Cryo-CLEM de cellules. Vue d'ensemble de l'image de microscopie optique Cryo de la partie centrale d'une grille de recherche qui est une superposition d'une image en fond noir (blanc) et d'une image de fluorescence (vert) de cellules marquées par fluorescence (à gauche), superposition de l'image de fluorescence cryoLM sur le cryo -Vue d'ensemble EM (blanc) (au milieu), le rectangle rouge indique la position du carré de maille montré à un grossissement plus élevé (à droite).

Nous avions deux motivations principales pour développer et construire ce dispositif de vitrification pour la préparation d'échantillons cryo-EM. Un premier objectif était de rendre le processus de vitrification plus cohérent, moins dépendant de l'utilisateur et plus facile à contrôler. Par conséquent, les étapes de manipulation de la grille ont été automatisées, de la prise d'une grille EM (hors de la boîte de grille personnalisée ; Fig. 1d) à la mise en place d'une grille cryo-EM entièrement traitée dans un conteneur cryogénique pour le stockage (et pour l'imagerie cryoLM dans des cassettes spécialisées )30. En intégrant également la décharge luminescente et l'application d'échantillons, l'interaction de l'utilisateur avec la grille est minimisée, ce qui présente l'avantage de minimiser la dégradation (froissement) ou la perte de la grille. Pour augmenter le confort d'utilisation, la liquéfaction du gaz cryogénique (éthane ou éthane/propane) et le maintien des niveaux de liquide cryogénique (éthane et azote) sont entièrement automatisés.

Un deuxième objectif était de préparer des grilles cryo-EM avec une épaisseur plus reproductible de la couche d'eau vitreuse et d'obtenir une rétroaction directe sur l'épaisseur et la distribution de l'échantillon sur la grille pendant la préparation. Avoir des connaissances préalables sur l'épaisseur de la couche d'eau vitreuse et la facilité d'utilisation générale de l'échantillon cryo préparé, avant d'effectuer l'imagerie par microscopie cryoélectronique, empêche les cycles fastidieux de préparation des échantillons et de contrôle de la qualité de la grille dans la microscopie cryoélectronique. Pour accéder aux informations sur l'épaisseur de la couche lors de l'élimination de l'eau, nous nous sommes abstenus d'utiliser du papier filtre, qui obscurcit la vue sur la grille, et avons plutôt décidé d'utiliser l'aspiration pour éliminer l'excès de liquide, en utilisant plusieurs tubes qui sont positionnés à le bord extérieur de la grille de microscopie électronique. En utilisant l'aspiration, la vitesse et la durée d'élimination du liquide peuvent être facilement réglées, contrairement au papier filtre conventionnel, car la vitesse d'élimination est une propriété intrinsèque du papier. Notre méthode a l'avantage supplémentaire de supprimer toute influence potentielle du papier filtre sur la chimie de l'échantillon18,31. Un avantage important de la configuration actuelle utilisant l'aspiration de liquide est qu'elle a permis le positionnement d'une lentille de microscopie optique avec caméra et éclairage pour les modes de réflexion et de transmission autour de la grille et l'observation de la grille lors du retrait de l'échantillon. Les expériences initiales utilisant une lentille × 20 ont fourni un champ de vision relativement large sur environ 45 carrés (5 × 9 carrés, 423 × 762 µm) avec une vue utilisable des trous de 2 microns. La configuration actuelle et préférée utilise un objectif × 10 (16 × 26 carrés; 1,35 mm × 2,2 mm avec un appareil photo amélioré de 20 MP) offrant une vue moins détaillée des trous individuels de 2 microns, mais offre une vue relativement large correspondant à environ 70 % de la surface totale de la grille qui peut être observée dans EM.

La comparaison de la microscopie optique enregistrée lors de la préparation et de la microscopie cryo-électronique résultante des grilles vitrifiées a démontré que l'épaisseur de l'eau vitrifiée dans la cryo-EM pouvait être estimée qualitativement à l'aide de la microscopie optique. À partir d'images de microscopie optique, les zones transparentes aux électrons dans le cryo-EM ont pu être facilement identifiées et même la différence entre les trous remplis d'eau et les trous vides dans le carbone a pu être observée. Même si le temps entre la dernière observation LM et la vitrification prend jusqu'à une seconde, il est suffisamment rapide pour que peu de changements apparaissent. L'épaisseur résultante des couches d'eau vitrifiée n'a pas été mesurée quantitativement mais sur la base de la taille des particules dans les différents échantillons et des données de tomographie, nous avons estimé que les couches d'eau vitrifiée résultantes varient entre environ 50 et 200 nm. Dans l'ensemble, l'observation par microscopie optique de l'interférence des couches minces donne une bonne estimation d'un moment de vitrification approprié et donne des grilles avec une épaisseur de couche d'eau vitrifiée qui sont pratiquement utilisables.

Bien que l'interférence de couche mince de lumière blanche puisse donner des informations détaillées sur l'épaisseur du film32, dans la configuration actuelle avec transmission et lumière réfléchie, la couleur exacte ne peut pas être déterminée. De plus, en dessous d'environ 100 nm, les films minces sont incolores et ne changent que d'intensité, ce qui ne peut pas être lié à une épaisseur spécifique car ceux-ci sont masqués par des différences d'intensité de fond. Cependant, l'analyse quantitative de couches minces dans la plage de 50 à 200 nm est importante pour déterminer l'épaisseur optimale pour la cryo-EM haute résolution de petites particules et ce serait une caractéristique souhaitable pour une configuration de piston. Avec des méthodes appropriées de détection et d'analyse à résolution spectrale, l'épaisseur quantitative du film liquide pourrait être déterminée optiquement. En principe, l'analyse des couleurs d'interférence utilisant la lumière de trois longueurs d'onde33 ou une combinaison d'holographie et d'interférométrie34 a été démontrée pour la mesure optique de film mince plein champ. Bien que la mesure de films d'une épaisseur inférieure à 100 nm nécessitera probablement des longueurs d'onde plus courtes.

L'eau en vrac peut être efficacement retirée du bord de la grille par aspiration à l'aide de deux ou trois tubes. Cela a entraîné une épaisseur de couche d'eau distribuée légèrement variable sur la grille, avec les zones plus épaisses près du centre de la grille et de la pointe de la pince à épiler, et les zones plus minces près de la périphérie de la grille. Cette variation d'épaisseur de glace est souhaitable et garantit que sur chaque grille un nombre minimum de cases utilisables est présent. L'optimisation de la vitesse d'aspiration est possible, mais entre nos mains, cela n'était pas nécessaire.

Étant donné que l'inspection visuelle donne une connaissance préalable de la qualité et de la facilité d'utilisation des grilles pour cryo-EM, seules les bonnes grilles sont transférées dans le TEM et utilisées pour l'acquisition de données et nous avons un rendement parfait de grilles, tout en éliminant les grilles occasionnelles qui ne se sont pas comportées bien pendant l'amincissement, par exemple en raison d'un pliage ou d'un film de support cassé, avant de plonger. Pour les échantillons de protéines et de liposomes purifiés, dans une seule grille, généralement un tiers des carrés (en particulier autour de la position des tubes d'aspiration) est trop sec et inutilisable pour la collecte de données, un tiers est utilisable (la grande majorité des trous d'aluminium sont couverts avec de l'eau vitreuse) et un tiers a un nombre à peu près égal de trous de feuille vides et remplis, ce qui fait que le nombre de carrés utilisables par grille varie entre 30 % et 60 % (n = 16). Pour les grilles avec bactéries et cellules adhérentes le rendement est bien meilleur car l'eau est mieux retenue autour de ces structures et elles sont moins sensibles au séchage.

Bien qu'il soit précieux d'avoir une connaissance préalable de l'épaisseur des couches d'eau vitreuse et de la distribution et de la quantité de surface utilisable sur une grille avant d'effectuer la cryo-EM, ce n'est pas la seule condition préalable pour disposer de grilles utilisables de haute qualité et de bonne qualité pour la collecte de données. . De plus, pour la collecte de données SPA, la qualité de l'échantillon en termes d'orientation préférentielle, d'agrégation, de concentration sur la surface de la grille et de perturbation des protéines35 sont des paramètres importants pour l'optimisation de la grille, qui semblent échapper à la détection par microscopie optique. Il est apparu qu'une agrégation étendue de protéines ou de vésicules pouvait être observée sur la grille par la configuration actuelle de la microscopie optique, très probablement à cause des variations d'épaisseur de la surface de l'eau. Nous n'avons pas étudié cela de manière approfondie, bien que nous aimions souligner que des techniques LM pour l'étude de l'agrégation des protéines sont proposées36,37, et l'utilisation de méthodes LM spectroscopiques ou de fluorescence supplémentaires lors de la préparation d'échantillons de films minces pourrait valoir la peine d'être explorée.

Contrairement à d'autres dispositifs de préparation d'échantillons récemment développés29, nous n'avons pas essayé de minimiser la quantité d'échantillon utilisée pour l'application sur la grille. Au lieu de cela, nous avons opté ici pour le développement d'un appareil avec une large applicabilité et avons donc évalué sa facilité d'utilisation pour une variété d'échantillons différents. L'apoferritine a été utilisée comme norme de flux de travail SPA pour évaluer la résolution de la reconstruction. En utilisant une seule session de vitrification, nous avons pu préparer 9 grilles de trois échantillons, dont nous avons utilisé une, sans aucune optimisation de l'épaisseur de la glace, pour une collecte de données pendant la nuit conduisant à une carte 3D de résolution 2,4 Å. Nous avons également préparé des échantillons de cube d'origami d'ADN pour cryo-ET. Ce type d'échantillon est connu pour s'agréger facilement et coller aux surfaces air-eau. Nos expériences ont donné des résultats très similaires par rapport aux expériences utilisant d'autres dispositifs de vitrification. Au cours de la même session, nous avons également préparé des échantillons pour cryo-EM sur plusieurs types de liposomes, ce qui a montré que ces échantillons peuvent être facilement préparés sans trop d'effort et d'optimisation. Plus important encore, à côté de la suspension de particules, des cellules bactériennes et cellulaires pourraient également être préparées pour l'imagerie cryo-EM et cryo-CLEM. Les échantillons préparés et les résultats cryo-EM étaient tous identiques aux mêmes échantillons qui ont été préparés à l'aide du Leica EM GP et du Thermo Fisher Scientific Vitrobot Mark IV, malgré les grandes différences de conception et de niveau d'automatisation.

Pour des raisons de biosécurité, il est important d'empêcher la libération de substances nocives. En outre, il est important d'éviter la contamination croisée entre les échantillons. Nous avons remarqué que sans un nettoyage approprié des pointes de pincettes ou un échange des tubes d'aspiration, on peut obtenir une contamination croisée des échantillons entre les grilles qui sont produites par la suite. Le nettoyage et la décontamination peuvent être réalisés en combinant l'utilisation d'éléments interchangeables, le rinçage et des mesures d'autoclavage à haute température. Les récipients de trempage des échantillons ainsi que les cartouches de prélèvement d'échantillons sont interchangeables et peuvent être autoclavés ou jetés, tous les tubes en silicone sont jetables et peuvent être échangés facilement. La gamme des bains de trempage est flexible et les étapes de rinçage ou de nettoyage de la pointe de la pince peuvent être configurées dans le logiciel et automatisées. L'assemblage de la pince à épiler, le tube d'aspiration en acier inoxydable et les modules mécaniques à proximité directe de l'échantillon pendant le processus d'aspiration peuvent facilement être échangés ou retirés et autoclavés. La chambre d'humidité peut être rincée avec, par exemple, de l'alcool isopropylique, de l'acétone ou de l'éthanol et la conception a de grands rayons pour faciliter le nettoyage. Bien que cela ne fasse pas partie du prototype testé dans cet article, nous avons ajouté et testé des filtres HEPA et des canaux d'échappement chauffés à haute température (~ 200 ° C) pour inactiver les composants biologiquement actifs dans les nouvelles versions.

Le dispositif présenté dans cet article est hautement automatisé et lors de la préparation, l'interaction de l'utilisateur n'est nécessaire que pour déterminer le moment souhaité pour plonger. Les développements futurs incluent la détection automatique du moment optimal pour la vitrification. Les résultats expérimentaux rapportés ici indiquent que les franges d'interférence des couches minces, qui apparaissent, changent et disparaissent lorsque l'épaisseur de la couche est réduite, fournissent une indication directe et claire de l'épaisseur du film résultant après vitrification de l'échantillon, sont faciles à juger par l'utilisateur. Alors que dans la configuration actuelle, la décision de plonger est prise par l'utilisateur, nous prévoyons qu'à l'avenir, cette décision sera mise en œuvre via un système de vision artificielle conventionnel ou basé sur l'IA. De plus, avec une détection et une analyse à résolution spectrale, l'épaisseur quantitative du film liquide pourrait être déterminée optiquement, rendant le processus de vitrification complètement indépendant de l'utilisateur.

L'apoferritine de rate de cheval a été achetée chez Sigma (9013-31-4) et purifiée immédiatement avant la vitrification par filtration sur gel sur une colonne Superdex 200 Augmentation 3,2/300 (Cytiva) dans du NaCl 150 mM. Tris 25 mM pH 7,5, tampon DTT 2 mM. La fraction de pic a été collectée et utilisée pour la préparation de l'échantillon à une concentration finale de 2,5 µM.

Des liposomes contenant de la dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), du dimyristoylphosphatidylglycérol (DMPG), du cholestérol et du DNP-cap-PE (44: 5: 50: 1 mol%) ont été préparés comme décrit précédemment en 2019 par Lubbers et al. 38. Les lipides (Avanti Polar Lipids, AL, États-Unis) ont été dissous dans du chloroforme-méthanol (9: 1 v / v) et séchés sous un flux d'azote gazeux pendant une nuit. Une concentration finale en lipides de 0,8 mg/ml a été obtenue en réhydratant le film lipidique dans 20 mM de sulforhodamine B (S1402 ; Sigma Aldrich, Missouri, USA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 à 37 °C pendant 30 min. . Le mélange lipidique réhydraté a été soniqué pendant 5 min à 37 ° C pour former des liposomes, qui ont été purifiés par chromatographie d'exclusion de taille à l'aide d'une colonne NAP-25 pré-remplie (17-0852-01; GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni). Les liposomes ont été mélangés avec 5 µg/ml d'anticorps monoclonaux IgG1 DNP39.

L'amphotéricine B liposomale (Ambisome®) a été utilisée dans les formulations décrites précédemment40,41 après dilution 10 fois dans l'eau.

Les cubes d'origami d'ADN ont été conçus à l'aide de TALOS42 en utilisant les préréglages de cube standard avec une longueur d'arête de 84 nucléotides. Des solutions de pliage ont été préparées dans des tubes PCR en mélangeant l'ADNss M13mp18 (20 nM, Bayou Biolabs) avec les agrafes d'ADNss appropriées (200 nM de chaque agrafe, Integrated DNA Technologies; voir les données supplémentaires 1) additionnées de 20 mM de MgCl2 dans un volume total de 50 μL. Les cubes d'origami d'ADN ont été recuits thermiquement dans un cycleur thermique Bio-Rad C1000 Touch™ en utilisant le protocole suivant : 80 °C jusqu'à 76 °C à une vitesse de 5 min/°C, 75 °C jusqu'à 30 °C à une vitesse de 13,75 min/0,5 °C, 29 °C jusqu'à 20 °C à une vitesse de 10 min/°C. Dix solutions de repliement de 50 μL ont été regroupées puis purifiées et concentrées à l'aide de filtres centrifuges Amicon® ultra 0,5 mL (MWCO : 100 kDa).

Des cellules de souris 17Clone1 ont été préparées comme décrit précédemment43 et marquées par fluorescence pendant 1 h avec MitoTracker™ (M7514, Invitrogen) à une concentration finale de 0,5 µM à partir d'un stock de 1 mM dans du DMSO. Tous les échantillons ont été préparés sur des grilles en cuivre Quantifoil 300 mesh avec un film de carbone R2/2.

Les grilles ont été chargées dans un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 300 kV, équipé d'un détecteur direct d'électrons Gatan K3 BioQuantum. Des films avec 50 images et une dose cumulée de 65 e/Å2 ont été acquis en mode comptage à l'aide du logiciel EPU (Thermo Fisher Scientific) à un grossissement de ×105 000, correspondant à une taille de pixel calibrée de 0,836 Å/pixel avec une plage de défocalisation de − 0,6 à -2,5 µm. Au total, 2348 films ont été collectés au cours de deux sessions de microscopie au Centre néerlandais de nanoscopie électronique (NeCEN). Les paramètres d'acquisition de données détaillés sont résumés dans la Fig. 1 supplémentaire et le tableau supplémentaire 1.

Le logiciel bêta RELION-3.144,45 a été utilisé pour tous les traitements d'images. En bref, les films collectés ont été soumis à une correction de dérive induite par le faisceau à l'aide de MotionCor246, la fonction de transfert de contraste a été estimée par CTFFIND-4.1.1847. Le sélecteur gaussien RELION a été utilisé pour sélectionner automatiquement 689 633 particules. Après deux cycles de classification 2D, les faux positifs et les caractéristiques contaminantes ont été rejetés, ce qui a donné un ensemble de données de 91 000 particules. Une carte d'apoferritine précédemment déterminée et filtrée à 40 Å a été utilisée comme référence pour le raffinement 3D. L'ensemble final de 91 000 particules a été soumis à un raffinement CTF pour les corrections d'aberration optique et d'inclinaison du faisceau ainsi qu'une défocalisation par particule, une correction d'astigmatisme par micrographie suivie d'un polissage bayésien45,48. Un deuxième raffinement 3D a ensuite été effectué donnant une carte de 2,4 Å. Les résolutions de carte ont été estimées au critère de 0, 143 de la courbe FSC corrigée par randomisation de phase calculée entre deux demi-cartes raffinées indépendamment multipliées par un masque de solvant à bords doux. Les reconstructions finales ont été affinées et filtrées localement dans le post-traitement RELION. Le modèle de rayons X de l'apoferritine de rate de cheval (entrée PDB 6RJH49) a été intégré à la densité EM en utilisant la fonction "fit in map" dans UCSF Chimera50 version 1.13.1 après avoir diminué la taille des pixels de la carte EM de 0,836 à 0,82 Å/pixel pour un meilleur ajustement. Les cartes ont été affichées en utilisant UCSF 1.13 et ChimeraX51.

Les images Cryo-EM ont été enregistrées sur un FEI Tecnai T12 Biotwin avec source LaB6, fonctionnant à 120 keV sur une caméra CCD FEI Eagle 4k × 4k, à l'aide d'un support cryo à entrée latérale Gatan 626. Pour la corrélation avec la dernière image LM enregistrée avant la vitrification, des images à faible grossissement (<×200) ont été enregistrées à la main, couvrant toute la grille. Des aperçus d'images composites de l'ensemble de la grille et des superpositions avec les images LM ont été réalisés dans Adobe Photoshop.

La cryo-ET a été réalisée sur un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 300 kV, équipé d'un détecteur d'électrons direct Gatan K3 BioQuantum. Les séries d'inclinaison ont été enregistrées à l'aide du logiciel TOMO 4 (Thermo Fisher Scientific) entre -56° et +56° avec un pas d'inclinaison de 2°, en commençant à 0°, avec une dose totale de 100 e/Å2 et 16 images par image à une grossissement nominal de x19,500, correspondant à une taille de pixel calibré de 4,4 Å/pixel avec une défocalisation de -7 µm. Les séries d'inclinaison de la tomographie cryo-électronique ont été reconstruites à l'aide du logiciel IMOD52,53. Les rendus de surface ont été réalisés à la main à l'aide du logiciel Amira (Thermo Fisher Scientific).

Cryo-LM a été réalisé sur un Zeiss Axioimager M2 équipé d'un Linkam CMS196M. Des piles d'images transparentes et fluorescentes (21 tranches tous les 75 µm) que nous avons enregistrées à l'aide d'un objectif EC PlanNeofluor × 10/0,30 Ph1 sur un AxioCam MR R3 à une taille de pixel au niveau de l'échantillon de 1 µm × 1 µm. Les images en fond clair ont été enregistrées à l'aide d'une source de lumière LED et les images fluorescentes ont été enregistrées à l'aide d'une source de lumière HXP 120 V à l'aide d'un jeu de filtres 38 HE. Les projections d'intensité maximale pour les deux piles d'images ont été réalisées à l'aide du logiciel Zeiss ZEN 3.4 et les superpositions ont été réalisées dans Adobe Photoshop 2021. Cryo-CLEM a été réalisée sur un Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 200 keV, équipé d'un électron direct Gatan K3 BioQuantum détecteur. Des corrélations ont été réalisées et les images ont été enregistrées à l'aide du logiciel MAPS (Thermo Fisher Scientific).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

La carte cryo-EM de l'apoferritine générée dans cette étude a été déposée dans l'EMDB sous le code d'accession EMD-13738. Les visualisations vidéo ont été créées à l'aide d'Adobe Premiere Pro, Maxon Cinema 4D et Maxon Redshift et sont disponibles en tant que films supplémentaires 1 et 2. Les données à l'appui de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Nous remercions Meindert Lamers, Willem Noteborn, Leoni Abendstein, Georg Wolff (CCB, LUMC) pour la préparation des échantillons. Ce travail a bénéficié d'un accès au Centre néerlandais de nanoscopie électronique (NeCEN) de l'Université de Leiden, un centre Instruct-ERIC. La microscopie électronique dans ce travail fait partie du programme de recherche Feuille de route nationale pour les infrastructures de recherche à grande échelle (NEMI), numéro de projet 184.034.014, qui est financé par le Conseil néerlandais de la recherche (NWO).

Microscopie électronique, biologie cellulaire et chimique, Centre médical universitaire de Leiden, PO Box 9600, 2300, RC, Leiden, Pays-Bas

Roman I. Koning et Abraham J. Koster

Linkam Scientific Instruments Ltd, Tadworth, Surrey, KT20 5LR, Royaume-Uni

Hildo Vader, Martijn van Nugteren, Peter A. Grocutt, Arnold CF Kamp et Michael Schwertner

NeCEN, Institut de biologie de Leiden, Université de Leiden, Bâtiment Gorlaeus, Einsteinweg 55, 2333, CC, Leiden, Pays-Bas

Wen Yang & Ludovic LR Renault

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RIK : conceptualisation, méthodologie, validation, enquête, rédaction - ébauche originale, visualisation, supervision. MvN : conceptualisation, méthodologie, validation, investigation. HV : conceptualisation, méthodologie, validation, investigation. PAG : Logiciel. AJK : rédaction, révision et édition, acquisition de financement. AK : conceptualisation, méthodologie, supervision, acquisition de financement. WJ : Collecte de données SPA. LLRR : analyse des données. MS : conceptualisation, méthodologie, rédaction—révision et édition, supervision.

Correspondance avec Roman I. Koning.

Linkam Scientific Instruments Ltd. a obtenu le brevet européen EP3018467 A1 "Préparation d'échantillons microscopiques" (inventeurs ACFK, MvN, HV, RIK et MS) ; PAG est un employé de Linkam Scientific Instruments ; ACFK est propriétaire de Linkam Scientific Instruments Ltd., Royaume-Uni. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Radostin Danev et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Koning, RI, Vader, H., van Nugteren, M. et al. Vitrification automatisée d'échantillons cryo-EM avec une épaisseur d'échantillon contrôlable à l'aide d'une aspiration et d'une inspection optique en temps réel. Nat Commun 13, 2985 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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Reçu : 02 décembre 2021

Accepté : 26 avril 2022

Publié: 27 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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